纳米材料致突变性评价方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种纳米材料致突变性评价方法及其应用，该方法先对纳米材料受试物和菌株进行酸化预处理，再进行致突变性评价实验，所述酸化预处理步骤为：将菌株以氯化钠暴露液重悬，加入纳米材料受试物，得到酸化暴露体系，放置反应，中和所述纳米材料受试物表面的负电荷和

【技术实现步骤摘要】
纳米材料致突变性评价方法及其应用


[0001]本专利技术涉及材料致突变性评估
，特别是涉及一种纳米材料致突变性评价方法及其应用
。

技术介绍

[0002]纳米材料是纳米级结构材料的简称，纳米颗粒的尺寸最多不超过
100nm。
广义的纳米材料是指微观结构至少在一维方向上不超过
100nm
的固体超细材料
。
纳米材料独特的小尺寸效应和物理化学特性使其在生物医药领域具有很好的应用前景
。
[0003]然而，随着纳米材料产品大量涌入日常生活，人体长期暴露于纳米材料环境下的安全风险已引起广泛关注
。
药品
、
化妆品
、
染料等产品中的纳米成分均存在脱落的风险
。
当颗粒物粒径为5～
10
μ
m
时可进入鼻腔和咽喉，较小的
PM 2.5(
粒径小于
2.5
μ
m)
颗粒会进入气管
、
支气管，直接损害肺泡，而粒径更小的纳米颗粒，其危害性更大，足以穿透人体的“生理屏障”对人体造成严重损伤
。
[0004]遗传毒性评价用于预测受试物的人体致癌性风险，是药品
、
化妆品
、
食品添加剂
、
医疗器械等进入临床试验及上市前必须开展的研究项目
。
纳米材料可与细胞中特定的细胞器相互作用；也可以穿过核膜，对细胞遗传物质产生直接或间接的作用，介导氧化应激或炎症等作用机制诱发染色体或
DNA
断裂，具有致癌性风险
。
[0005]目前，使用营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌开展的细菌回复性突变试验
(Ames
试验
)
是公认的可靠且简便的致突变性评价方法
。Ames
试验对引起大鼠肿瘤化合物的预测一致度为
69
％，对引起恒河猴肿瘤化合物的预测一致度高达
87.5
％
。
然而，经济与合作组织
(OECD)
对
2002
～
2010
年间
17
项纳米材料
Ames
试验结果进行了汇总，发现其中
15
项结果均为阴性，提示结果存在不准确的可能
。
[0006]因此，目前缺乏适宜对纳米材料致突变性进行评价的方法，难以判断纳米材料是否导致基因突变
。

技术实现思路

[0007]基于此，有必要针对纳米材料缺乏适宜致突变性评价方法的问题，提供一种纳米材料致突变性评价方法，能够准确评价纳米材料的致突变性
。
[0008]一种纳米材料致突变性评价方法，先对纳米材料受试物和菌株进行酸化预处理，再进行致突变性评价实验，所述酸化预处理步骤为：将菌株以氯化钠暴露液重悬，加入纳米材料受试物，得到酸化暴露体系，放置反应，中和所述纳米材料受试物表面的负电荷和
/
或使纳米材料受试物表面呈正电性，得到待测溶液
。
[0009]本专利技术人在前期调查研究中发现，从试验角度来看，传统
Ames
试验体系不适合对纳米材料进行评价，可能原因包括以下几点：
1)
纳米材料颗粒在琼脂中快速聚集，不利于纳米材料与细菌菌株的充分接触；
2)
试验所用的测试菌常为革兰氏阴性菌，其等电点为
pH4
～5，而培养体系
pH
一般大于细菌等电点，测试细菌细胞壁还含有大量磷酸基，带负电荷，而多
数纳米材料携带负电，呈碱性，因此纳米材料与细菌之间存在静电排斥，难以充分接触
。
[0010]在上述研究基础上，本专利技术人提出，使用氯化钠预暴露溶液对试验体系进行酸化预处理，中和纳米材料表面负电荷，或使其带上正电，减少细菌与纳米材料之间的静电排斥，从而避免纳米材料与细菌之间存在静电排斥导致评价结果不准确的问题
。
[0011]在其中一个实施例中，所述纳米材料表面呈负电性
。
例如为了避免纳米材料在体内聚集
、
在血液中吸附过多蛋白或其他小分子的目的，在合成时常通过表面官能团设计使其带负电的生物医药纳米材料
(
即毒理学评价的对象
)
等
。
[0012]在其中一个实施例中，所述氯化钠暴露液为
10
±
5mM
的氯化钠水溶液；所述酸化暴露体系中，所述菌株的密度为5×
108个
/mL
～5×
109个
/mL(
即
OD
600
约为
0.4
‑
0.6)。
可以理解的，当氯化钠暴露液浓度过低，无法充分中和所述纳米材料受试物表面的负电荷，而当氯化钠暴露液浓度过高，又可能对菌株生长产生不利影响，采用上述的暴露液浓度和菌株密度相配合，具有较好的预处理效果，可以使菌株充分与纳米材料接触
、
反应，得到更为准确的评估结果
。
[0013]在其中一个实施例中，所述酸化暴露体系通过以下方法得到，将菌株以氯化钠暴露液重悬得到菌液
(
通常控制此时
OD
600
为2‑
3)
，取所述菌液，以氯化钠暴露液稀释
100
±
20
倍，再加入纳米材料受试物，即得
。
[0014]在其中一个实施例中，所述菌株通过以下方法得到：取菌液，离心分离去除溶液，并以氯化钠暴露液清洗1‑3次，去除清洗液，即得
。
[0015]在其中一个实施例中，所述放置反应的条件为：在
37
±
2℃
下恒温
100
～
120rpm
振荡培养
30
±
10min。
[0016]在其中一个实施例中，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株
。
[0017]在其中一个实施例中，所述菌株选自：
TA98、TA100
菌株
。
其中，
TA98
可检出移码突变，
TA100
可检出碱基置换
。
且以
TA98、TA100
菌株进行测试，其测试结果可靠性更高
。
[0018]在其中一个实施例中，当所述纳米材料为
SiO2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株
TA98
；当所述纳米材料为
TiO2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株
TA100。
以上述菌株检测对应材料，具有较优的测试效果
。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，先对纳米材料受试物和菌株进行酸化预处理，再进行致突变性评价实验，所述酸化预处理步骤为：将菌株以氯化钠暴露液重悬，加入纳米材料受试物，得到酸化暴露体系，放置反应，中和所述纳米材料受试物表面的负电荷和
/
或使纳米材料受试物表面呈正电性，得到待测溶液
。2.
根据权利要求1所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述纳米材料表面呈负电性
。3.
根据权利要求1所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述氯化钠暴露液为
10
±
5mM
的氯化钠水溶液；所述酸化暴露体系中，菌株密度为5×
108个
/mL
～5×
109个
/mL。4.
根据权利要求3所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述酸化暴露体系通过以下方法得到，将菌株以氯化钠暴露液重悬得到菌液，取所述菌液，以氯化钠暴露液稀释
100
±
20
倍，再加入纳米材料受试物，即得
。5.
根据权利要求1所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述放置反应的条件为：在
37
±
2℃
下恒温
100
～
120rpm
振荡培养
30
±
10min。6.
根据权利要求1所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，当所述纳米材料为
SiO2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株
TA98
；当所述纳米材料为
TiO2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株
TA100。7.
根据权利要求1‑6任一项所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述致突变性评价实验采用液态细胞培养体系进行，具体包括以下步骤：回复突变试验：取完成酸化预处理的待测溶液，建立液态非代谢活化培养体系和液态代谢活化培养体系进行试验，其中，非代谢活化试验方法为：取所述待测溶液，加入液态非代谢活化选择性生长培养基，得到测试组，同时设置阴性对照组，在小孔板中进行细胞培养；代谢活化试验方法为：取所述待测溶液，加入液态酸化代谢活化选择性生长培养基，得到测试组，同时设置阴性对照组，在小孔板中进行细胞预培养，预培养预定时间后，再补充所述液态酸化代谢活化选择性培养基，继续培养；致突变性评价：向上述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系中加入指示剂，对培养体系的显色情况进行分析，得到纳米材料受试物的致突变性评价结果
。8.
根据权利要求7所述的纳米材料致突变性评价方法，其特征在于，所述指示剂为溴麝香草酚蓝；所述非代谢活化试验方法为：取所述待测溶液
0.5mL
，加入液态非代谢活化选择性生长培养基
19.5mL

【专利技术属性】
技术研发人员：文海若，耿兴超，汪祺，杨颖，王亚楠，吴辉，宋捷，王三龙，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：