检测黄曲霉毒素制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素

【技术实现步骤摘要】
检测黄曲霉毒素M1的量子点荧光猝灭免疫分析方法


[0001]本专利技术涉及免疫分析
，尤其涉及一种检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法
。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素是由常见的黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的次级代谢产物
,
是污染农产品的众多真菌毒素中毒性最大的一类，主要包括黄曲霉毒素
B1(aflatoxin B1
，
AFB1)、B2、G1、G2
和两种主要的代谢物黄曲霉毒素
M1、M2。
黄曲霉毒素
M1(AFM1)
是哺乳动物误食被黄曲霉毒素
B1
污染的饲料后，经体内循环代谢产生的羟基衍生物，主要存在于牛奶以及各种乳制品当中
。AFM1
具有强致癌性和致突变性，表现在
AFM1
会与
DNA
的嘌呤残基结合导致
DNA
结构和功能改变，从而破坏组织器官产生癌变，尤其危害肝脏器官
。
因此，我国对
AFM1
在牛奶中的含量制定了严格的限量标准，
GB2761—2017《
食品安全国家标准食品中真菌毒素限量
》
规定乳制品中
AFM1
含量不得超过
0.5
μ
g/kg。
[0003]目前，对
AFM1
的常用检测方法包括高效液相色谱法
、
液相色谱
‑/>质谱法等仪器分析法，这些方法表现出分离性能好
、
灵敏度高等特点，但检测过程需要耗时的预处理步骤
、
昂贵的设备以及专业的操作人员，限制了方法的广泛应用
。
因此，开发快速
、
经济
、
灵敏和高特异性的检测技术用于检测牛奶制品中
AFM1
残留是非常必要的
。
酶联免疫吸附法
(ELISA)
是一种基于抗原
(
或抗体
)
作为选择性化学试剂特异性测定分析抗体
(
或抗原
)
的技术，具有操作简单
、
专一性强等优点，适于真菌毒素残留的现场快速检测
。
然而，较低的信噪比
(S/N)
导致中等灵敏度是
ELISA
方法的最大限制，阻碍了其在食品分析中的广泛应用，如何提升检测灵敏度是进一步拓展
ELISA
在食品安全检测领域应用的重要研究方向
。

技术实现思路

[0004]本专利技术以黄曲霉毒素
M1
为研究对象，利用
PBNPs
纳米酶催化产生一次信号放大效应，再进一步利用纳米酶催化产物造成量子点出现荧光猝灭产生二次信号放大效应，构建基于量子点荧光猝灭的荧光免疫分析技术，用于黄曲霉毒素
M1
的快速检测，实现进一步增强检测灵敏度和稳定性的目的
。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供的检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法，是以经过硅烷化修饰的
PBNPs
与黄曲霉毒素
M1
包被原偶联作为酶标记物，将酶标记物
、
样品加入到包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板中进行竞争反应，然后加入底物
TMB
和
H2O2进行酶促反应，最后加入量子点孵育，在
340nm
波长激发下测定
525nm
发射波长处的荧光强度，根据荧光结果定性或定量检测样品中的黄曲霉毒素
M1。
[0006]作为对上述技术方案的限定，检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法包括如下步骤：
[0007](1)
获取包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板；
[0008](2)
通过活化酯法将黄曲霉毒素
M1
与卵清蛋白
OVA
偶联，制备黄曲霉毒素
M1
包被
原；通过水热法制得水溶性
PBNPs
，再对其进行硅烷化修饰，得到羧基功能化纳米粒子；通过
EDC
‑
NHS
法将黄曲霉毒素
M1
包被原与修饰后的
PBNPs
偶联，制备酶标记物
。
[0009](3)
将步骤
(2)
的酶标记物与样品加入到步骤
(1)
的包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板中进行竞争反应，然后加入底物
TMB
和
H2O2，进行酶促反应；之后加入量子点孵育，在
340nm
波长激发下测定
525nm
发射波长处的荧光强度，根据荧光结果定性或定量检测样品中的黄曲霉毒素
M1。
[0010]使用荧光对应物代替吸收信号，是一种可行
、
有效和常用的策略，可以达到更高的信噪比和灵敏度
。
量子点
(QDs)
具有
Stokes
位移大
、
光学稳定性好
、
量子产率高
、
发射波长可调等独特的优点，在病原体监测
、
蛋白质追踪等物质的免疫分析中被用作抗体的信号标记，其灵敏度与
ELISA
相当
。
然而，该策略牺牲了酶促反应的信号放大，如果在荧光免疫分析中同时使用酶扩增和荧光信号读数，可以获得更高的灵敏度
。
[0011]本专利技术的免疫分析方法所用的
PBNPs(
普鲁士蓝纳米酶
)
是一种常用的蓝色颜料，溶液本身呈蓝色，具有很强的光吸收性，
PBNPs
凭借其优越的稳定性
、
制备方式的多样性和良好的光热效果，在传感器
、
电化学
、
生物治疗
、
生物成像等方面多有应用
。
此外，
PBNPs
由化学式为
Fe4[Fe(CN)6]3的配位聚合物组成，具有类过氧化物酶样活性，这一特性有助于替代
ELISA
中的天然酶；且
PBNPs
的类过氧化物酶活性很高，能够催化过氧化氢分解，使
TMB(3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺
)
变色
。
由此，本专利技术利用
PBNPs
催化产生一次信号放大效应，再进一步利用
PBNPs
催化产物造成量子点出现荧光猝灭产生二次信号放大效应，从而改变了传统
ELISA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法，其特征在于：该免疫分析方法以经过硅烷化修饰的
PBNPs
与黄曲霉毒素
M1
包被原偶联作为酶标记物，将酶标记物
、
样品加入到包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板中进行竞争反应，然后加入底物
TMB
和
H2O2进行酶促反应，最后加入量子点孵育，在
340nm
波长激发下测定
525nm
发射波长处的荧光强度，根据荧光结果定性或定量检测样品中的黄曲霉毒素
M1。2.
根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
获取包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板；
(2)
通过活化酯法将黄曲霉毒素
M1
与卵清蛋白
OVA
偶联，制备黄曲霉毒素
M1
包被原；通过水热法制得水溶性
PBNPs
，再对其进行硅烷化修饰；通过
EDC
‑
NHS
法将黄曲霉毒素
M1
包被原与修饰后的
PBNPs
偶联，制备酶标记物；
(3)
将步骤
(2)
的酶标记物与样品加入到步骤
(1)
的包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板中进行竞争反应，然后加入底物
TMB
和
H2O2，进行酶促反应；之后加入量子点孵育，在
340nm
波长激发下测定
525nm
发射波长处的荧光强度，根据荧光结果定性或定量检测样品中的黄曲霉毒素
M1。3.
根据权利要求2所述检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法，其特征在于：步骤
(1)
包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板，是通过将黄曲霉毒素
M1
抗体用包被液稀释至确定浓度，以
100
～
150
μ
L/well
的量包被在聚苯乙烯酶标板上，
4℃
孵育过夜后封闭得到
。4.
根据权利要求3所述检测黄曲霉毒素
M1
的量子点荧光猝灭免疫分析方法，其特征在于，步骤
(1)
的具体操作如下：将黄曲霉毒素
M1
用包被液稀释至
(0.5
～
1.2)
μ
g/100
μ
L
，然后以
100
～
150
μ
L/well
的量包被在聚苯乙烯酶标板上，
4℃
孵育过夜，然后弃去酶标板孔中的包被液，用
PBST
洗液清洗酶标板，随后用
150
～
250
μ
L、
含小牛血清
BCS
的
PBS
缓冲液作为封闭液将酶标板封闭，
37℃
孵育
1h
，弃去封闭液，再用
PBST
洗液清洗酶标板，得到包被黄曲霉毒素
M1
抗体的酶标板；所述封闭液中每
100mL PBS
缓冲液需加入小牛血清
...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡高爽，高山，郝建雄，韩雪，刘紫洋，俞清秀，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：