米黑根毛霉脂肪酶变体及其用途制造技术

本文公开了一种脂肪酶变体，其包含

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】米黑根毛霉脂肪酶变体及其用途
[0001]本申请要求于
2021
年3月
30
日提交的题为“Variants of Rhizomucor miehei lipase and uses thereof(
米黑根毛霉
(Rhizomucor miehei)
脂肪酶变体及其用途
)”的新加坡专利申请号
10202103274U
的优先权，该专利申请的全部内容通过引用纳入本文
。

技术介绍

[0002]三酰基甘油脂肪酶属于水解酶类，可裂解羧酸酯的酯键
(E.C.3.1.1.)。
脂肪酶的特殊性质是它们能够有效裂解脂质
(
不同类型的天然脂肪和油
)
的甘油和脂肪酸之间的酯键
。
目前，脂肪酶是在各种行业
(
包括清洁剂
、
制药
、
食品和生物燃料
)
中有应用的最广泛使用的酶类之一
。
[0003]米黑根毛霉脂肪酶
(RML)(
成熟肽如
SEQ ID No.2
所示
)
是工业过程中更常用的脂肪酶之一
。
其应用之一是生产母乳脂肪替代品，其中它可以进行酯交换或酸解
。
不同的过程对脂肪酶性质
(
例如热稳定性
、
耐化学性
、
最佳活性的
pH
值以及底物特异性/>)
的要求不同
。
为了适应
RML
的应用，人们在工程改造方面进行了努力以提高其热稳定性
(Zhang
等，
2012)
和对映选择性
(Holmquist
等，
1993)。
然而，无论应用如何，比活性仍然是脂肪酶最重要的特性之一，因为酶的比活性较高可以节省酶和时间
。
因此，我们工程改造得到了具有改良活性的
RML
变体
。
[0004]目前已知有几种提高脂肪酶比活性的方式
。
最流行的方式包括操纵底物结合口袋
(Lafaqui
è
re
等，
2009)、
盖结构域
(Khan
等，
20)
和表面环
(Yedavalli
等，
2013)。
这些操作可以通过随机诱变或定点诱变来实现
。
此前，位点饱和诱变已成功用于鉴定在清洁剂中应用的具有更高比活性和更高稳定性的
RML
变体
(Balumuri
等，
2015)。

技术实现思路

[0005]在本专利技术的第一方面，提供了一种脂肪酶变体，其包含
SEQ ID No.2
的脂肪酶序列的第一取代基
(substituent)
，其中
SEQ ID No.2
中的第一取代基的位置选自以下组：位置
251、
位置
204、
位置
254、
位置
237
和位置
243。
优选地，所述第一取代基的疏水性低于苯丙氨酸
。
[0006]优选地，所述第一取代基的位置在位置
251
并且所述第一取代基选自以下组：天冬酰胺
、
丙氨酸
、
半胱氨酸
、
天冬氨酸
、
谷氨酸
、
甘氨酸
、
组氨酸，异亮氨酸
、
赖氨酸
、
亮氨酸
、
甲硫氨酸
、
脯氨酸
、
谷氨酰胺
、
精氨酸
、
丝氨酸
、
苏氨酸
、
缬氨酸
、
色氨酸和酪氨酸
。
有利地，在野生型位置
251
处的苯丙氨酸可以被任何其他天然氨基酸取代
。
[0007]优选地，所述第一取代基的位置在位置
204
并且所述第一取代基选自以下组：疏水性较高
、
疏水性较低
、
极性且不带电
、
带负电和带正电，其中荷电在
pH
值为7时相对于第一取代基确定
。
优选地，所述第一取代基的位置在位置
204
并且所述第一取代基选自以下组：苯丙氨酸
、
亮氨酸
、
甲硫氨酸
、
酪氨酸
、
色氨酸
、
丙氨酸
、
缬氨酸
、
甘氨酸
、
甲硫氨酸
、
脯氨酸
、
丝氨酸
、
苏氨酸
、
天冬酰胺
、
谷氨酰胺
、
天冬氨酸
、
谷氨酸
、
精氨酸
、
组氨酸和赖氨酸
。
更优选地，所述第一取代基选自以下组：丙氨酸
、
天冬氨酸
、
苯丙氨酸
、
天冬酰胺和精氨酸
。
有利地，在
No.6
和
SEQ ID No.7
中的任一个
。
[0016]在各种实施方式中，脂肪酶变体与
SEQ ID NO:2
的序列具有至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％或至少
99
％序列同一性
。
[0017]在本专利技术的所有方面，所述脂肪酶变体包含如说明书中所述的取代基或
SEQ ID No
，或基本上由如说明书中所述的取代基或
SEQ ID No
组成，或由如说明书中所述的取代基或
SEQ ID No
组成
。
例如，脂肪酶变体可包含
SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58
和
SEQ ID No.59。15.
根据权利要求1所述的脂肪酶变体，其包含
SEQ ID No.2
的脂肪酶序列的第六取代基，其中所述第一取代基和所述第六取代基位于或邻近所述脂肪酶序列的表面环区域，其中所述第一取代基是天冬酰胺并且第六取代基为苏氨酸，所述第六取代基距离第一取代基两个氨基酸位置
。16.
根据权利要求
15
所述的脂肪酶变体，其中所述第一取代基和第六取代基选自以下组：
S237N
和
L239T、D243N
和
S245T
以及
F251N
和
S253T。17.
一种方法，其包括提供根据权利要求1至
16
中任一项所述的脂肪酶变体
、
第一酯和反应物，其中所述反应物选自以下组：水
、
酸和第二酯；以及在合适的反应条件下借助脂肪酶变体在第一酯和反应物之间形成反应产物
。18.
根据权利要求
17
所述的方法，其中所述第一酯是脂肪酸酯，优选三酰基甘油酯
。19.
根据权利要求
18
所述的方法，其中所述脂肪酸酯或三酰基甘油酯选自以下组：橄榄油
、
蓖麻油
、
葵花籽油
、
高油酸葵花籽油
、
菜籽油
、
高油酸菜籽油
、
棕榈油
、
富含三棕榈酸甘油酯的棕榈级分
、
乳木果油
、
乳木果油精
、
芥花油
、
三辛酸甘油酯
、
三丁酸甘油酯
、
辛酸甲酯
、
癸酸甲酯
...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑隽诗，欧雷戈，
申请(专利权)人：丰益国际有限公司，
类型：发明
国别省市：