一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种甜菜碱修饰毕赤酵母表面展示脂肪酶的制备方法及应用。本发明专利技术通过锚定蛋白Aga2，将疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL分泌表达到重组毕赤酵母的细胞表面上，集表达、纯化、固定化于一体，获得全细胞催化剂。同时提出通过甜菜碱修饰提高表面展示脂肪酶TLL的稳定性的方法。本发明专利技术解决了生物酶法催化制备生物柴油过程中存在的脂肪酶不稳定与低效率的问题，同时也为生物酶法制备生物柴油提供了新型全细胞生物催化剂，具有良好的工业化应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及到一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]生物柴油是一种可代替石化柴油的可再生清洁能源，具有良好的燃烧特性，较高的安全性和发动机低温启动性能，受到广泛关注。相比于传统的化学法制备生物柴油，生物酶法是一种绿色、可持续的生产方式，具有反应条件温和、对原料要求低、后处理简单、催化剂无毒等优点。但酶催化剂普遍存在制备成本高、催化效率低、稳定性差等问题，极大地限制了其工业化应用。
[0003]为了克服这些障碍，本专利技术中提出了酵母表面展示脂肪酶的方案。巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表面展示技术基本原理是以细胞表面的蛋白作为锚定蛋白，通过分子生物学技术，将锚定蛋白的基因序列与外源蛋白基因序列融合后导入毕赤酵母基因组中，信号肽引导分泌表达，使得融合蛋白与细胞表面会以非共价或共价作用结合，从而实现外源蛋白与锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母细胞的表面。脂肪酶被展示于毕赤酵母表面后可保持其相对独立的蛋白结构和功能，并可以通过回收宿主细胞实现脂肪酶的获取，使得表达、纯化、固定化于一体，可以直接应用于酶催化反应，从而省去分泌蛋白提取纯化和固定化的繁琐工艺流程，节约成本。因此，构建脂肪酶的表面展示菌株进行生物柴油的制备具有很大的实际意义。
[0004]虽然表面展示具有诸多优点，但仍存在使用稳定性差的问题，因此如何提高表面展示脂肪酶这一全细胞催化剂的稳定性仍是一个急需解决的问题，对酵母表面进行创新性的修饰无论对科研还是对实际应用都有巨大意义。

技术实现思路

[0005]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0007]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法及应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案一种表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其包括如下步骤：使用锚定蛋白进行脂肪酶的表面展示，所述脂肪酶位于锚定蛋白的C端，确定锚定完成后制得表面展示脂肪酶的毕赤酵母重组菌。
[0009]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL。
[0010]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所
示。
[0011]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白为Aga2。
[0012]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：锚定蛋白将脂肪酶与毕赤酵母相连。
[0014]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：毕赤酵母为KM71H，菌株保藏号：CCTCC M 2023046。
[0015]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：毕赤酵母表达载体为pPICZαA载体。
[0016]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：甜菜碱与表面展示脂肪酶的毕赤酵母共同孵育，从而制得甜菜碱修饰毕赤酵母表面展示脂肪酶。
[0017]作为本专利技术所述的一种优选方案，其中：甜菜碱修饰脂肪酶表面展示毕赤酵母全细胞催化剂，应用于催化制备生物柴油。
[0018]本专利技术有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种毕赤酵母表面展示脂肪酶TLL的方法以及得到的特定重组菌D
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TLL，重组菌D
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TLL的在实际中酶活能够达到2274.7U/g干细胞，为目前报道的脂肪酶TLL表面展示体系中的最高水平；经甜菜碱修饰后，所获得的全细胞催化剂D
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TLL
‑
betaine用于催化制备生物柴油，具有催化效率高，反应时间短，反应条件温和，高效，绿色安全等优点。使工程菌的工业价值得到进一步提高，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0021]图1为连接肽对表面展示脂肪酶TLL的影响；
[0022]图2为锚定蛋白及融合方式对表面展示脂肪酶TLL的影响；
[0023]图3为修饰物对全细胞催化剂重复使用次数的影响；
[0024]图4为甜菜碱修饰的全细胞催化剂D
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TLL
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betaine的傅里叶红外光谱图；
[0025]图5为D
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TLL和D
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TLL
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betaine在油水界面的现象；
[0026]图6为D
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TLL和D
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TLL
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betaine的热稳定性；
[0027]图7为D
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TLL和D
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TLL
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betaine的甲醇耐受性；
[0028]图8为D
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TLL和D
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TLL
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betaine在催化制备生物柴油过程中的重复使用次数；
[0029]图9为全细胞催化剂催化制备生物柴油的反应条件优化的数据图；
[0030]图10为本专利技术实施例5中全细胞催化剂D
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TLL
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betaine催化不同种类的油脂原料制备生物柴油得率数据图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0032]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0033]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0034]实施例1
[0035]本实施例主要目的是筛选连接肽和锚定蛋白，以构建最优的脂肪酶TLL的毕赤酵母表面展示体系：
[0036]1、连接肽的筛选
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：使用锚定蛋白进行脂肪酶的细胞表面展示，所述脂肪酶位于锚定蛋白的C端，制得的表面展示脂肪酶毕赤酵母重组菌，菌株保藏号：CCTCC M2023046；利用甜菜碱对制得的表面展示脂肪酶毕赤酵母重组菌进行表面修饰，得到全细胞催化剂。2.根据权利要求1所述的甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL。3.根据权利要求1或2所述的甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：所述锚定蛋白为Aga2。5.根据权利要求1或4所述的甜菜碱修饰表面展示脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：所述锚定蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，许蕊，李迅，王晓月，陈紫荣，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：