一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术利用蛋白质融合技术，在体外对扩展青霉来源的脂肪酶进行蛋白质融合，获得酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白。在国标法的反应条件下，RZ

【技术实现步骤摘要】
一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程、酶工程及食品工程
，涉及酶活性和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，尤其是一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类能水解三酰甘油酯的酯酶。其在油水界面可以将三酰基甘油分解为脂肪酸、甘油等，而在有机相中，可以是脂类化合物分解、合成和酯交换。作为一种生物催化剂，脂肪酶参与的催化反应具有立体选择性高、副反应少、反应调节温和的特点。这些特性使得脂肪酶可以在医药、饲料、洗涤、食品加工等多个领域有这广泛的应用。
[0003]脂肪酶具有巨大的商业应用价值，是蛋白酶、糖酶之后第三大酶制剂，市场需求大。然而很少天然脂肪酶能够在生产便捷和经济节约等条件下，高效率地催化人们所期望的反应。现有的脂肪酶普遍存在产量低、酶活力不高且在高温条件下容易失活等问题。在食品加工等领域缺乏高催化活性和稳定性的脂肪酶。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白、方法及应用。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]如上所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：
[0008]将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。
[0009]编码如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因。
[0010]包含如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。
[0011]进一步地，所述重组载体采用的表达载体为通过基因重组制备蛋白质的表达载体PPIC9K、PPIC3.5K中的一种。
[0012]进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞是PichiapastorisGS115。
[0013]如上所述的重组载体或重组菌株在脂肪酶融合蛋白制备中的应用。
[0014]如上所述的脂肪酶融合蛋白在催化油脂水解中的应用。
[0015]进一步地，所述脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
[0016]本专利技术取得的优点和积极效果为：
[0017]1、本专利技术利用蛋白质融合技术，在体外对扩展青霉来源的脂肪酶进行蛋白质融
合，获得酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白。在国标法(GB/T 23535
‑
2009)的反应条件下，RZ
Ⅰ‑
WT的比酶活为188U/G，野生型脂肪酶WT的比酶活为138U/g(如图3)，提高了36％。RZ
Ⅰ‑
WT最适反应温度提高了5℃，最高比酶活为206U/g(如图4)。
[0018]2、本专利技术主要通过蛋白组合，筛选获得了脂肪酶活性和稳定性提高的融合蛋白。脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
[0019]3、本专利技术脂肪酶融合蛋白较野生型比活性提高了36％，最适温度提高了5℃，提高了扩展青霉脂肪酶的催化效率和最适反应温度，更好的应用于工业生产中。
附图说明
[0020]图1为本专利技术中脂肪酶WT(左)与融合蛋白RZ
Ⅰ‑
WT(右)的表达质粒图谱；
[0021]图2为本专利技术中脂肪酶筛选平板图(红色为GS115空菌、黄色为融合蛋白、蓝色为WT)；
[0022]图3为本专利技术中融合蛋白和野生型在40℃时的比活性图；
[0023]图4为本专利技术中野生型脂肪酶WT与融合蛋白RZ
Ⅰ‑
WT不同下的温度比活性图(最适温度曲线图)。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。
[0025]具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本专利技术申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0026]一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0027]如上所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：
[0028]将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。
[0029]编码如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因。
[0030]包含如上所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。
[0031]较优地，所述重组载体采用的表达载体为通过基因重组制备蛋白质的表达载体PPIC9K、PPIC3.5K中的一种。
[0032]较优地，所述重组菌株采用的宿主细胞是PichiapastorisGS115。
[0033]如上所述的重组载体或重组菌株在脂肪酶融合蛋白制备中的应用。
[0034]如上所述的脂肪酶融合蛋白在催化油脂水解中的应用。
[0035]较优地，所述脂肪酶融合蛋白能够将三酰基甘油的酯键生成甘油和脂肪酸；并且，所述脂肪酶融合蛋白相比野生型酶活性和最适温度有所提高。
[0036]具体地，相关的制备及检测如下：
[0037]本专利技术所用脂肪酶酶活测定方法如下：
[0038]脂肪酶的活力测定方法参照橄榄油乳化法(GB/T 23535
‑
2009)：脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸，甘油二酯，甘油单酯和甘油。所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用酚酞指示剂指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。
[0039]酶活单位的定义：在温度为40℃，pH值为7.5的条件下，样品水解脂肪每分钟释放出的1μmol游离脂肪酸，即为1个脂肪酶活力单位(U)。
[0040](1)测定步骤
[0041]取4mL橄榄油与PVA的乳化液加入到5mL、25mmol/L的磷酸盐缓冲液(PH7.5)，40℃水浴预热5分钟。实验组加入1mL适当稀释的酶液(公知)，在40℃水浴的条件下反应15分钟，加入15mL 95％的乙醇终止反应，对照的操作方法为：先加入15mL终止液再加1mL适当稀释过的酶液(公知)，用0.05MOL/LNaOH滴定样品和对照中生成的脂肪酸，计算消耗0.05mol/L的NaOH的量。
[0042本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶活和最适温度提高的脂肪酶融合蛋白，其特征在于：所述脂肪酶融合蛋白是在SEQ ID NO.2所示的野生型脂肪酶酶基础上，将RZⅠ蛋白添加到脂肪酶N端获得的，所述脂肪酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将密码子优化后的融合蛋白基因合成到PPIC9K表达载体上；其中，融合蛋白基因的序列为SEQ ID NO.3所示。3.编码如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的基因。4.包含如权利要求1所述的脂肪酶融合蛋白的基因的重组载体或重组菌株。5.根据权利要求4所述的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会图，路福平，公为峰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：