一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺

【技术实现步骤摘要】
一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺


[0001]本专利技术涉及细胞冻存液
，具体涉及一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺
。

技术介绍

[0002]细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，通常需要使用冻存液对细胞进行冻存，常见的冻存液会加入二甲基亚砜
DMSO
，然而
DMSO
有一定的细胞毒性，可能造成细胞结构和功能的不可逆损伤，影响干细胞的存活率，导致临床患者细胞移植后出现不良反应
。
[0003]目前，干细胞冻存液会使用到羟乙基淀粉和海藻糖等非渗透型组分，有良好的抗冻性能和抑制渗透损伤的能力，能够在低温条件下稳定细胞膜结构，但是非渗透型组分难以进入细胞内，保存细胞的效果有限，因此，亟需开发一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺，通过使用非渗透型组分和天然渗透型组分复配，使干细胞维持与新鲜细胞相似的形态和活力，从而满足临床治疗用细胞的冻存要求
。

技术实现思路

[0004]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种提高干细胞存活率的冻存液及其制备工艺
。
[0005]一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，具体包括以下步骤：
[0006]S1
：制备细胞外冻存保护剂
[0007]将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，通过无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂；
[0008]S2
：制备细胞内冻存保护剂
[0009]将脯氨酸加入无血清培养基中，得到浓度为
20
％～
22
％的脯氨酸溶液，通过
0.20
‑
0.22
μ
m
无菌滤膜对脯氨酸溶液进行过滤除菌，得到细胞内冻存保护剂；
[0010]S3
：制备稳定剂
[0011]将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置加热，通过紫外线灯进行灭菌消毒，甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容器内的甲基纤维素冷却，加入无血清培养基后，通过搅拌器将甲基纤维素搅拌均匀，将搅拌容器放入冷冻装置内保存，通过水浴装置使甲基纤维素溶液融化，得到稳定剂，通过无菌分装设备将稳定剂装入分装容器中，通过冷冻装置对分装好的稳定剂进行储存；
[0012]S4
：制备
PBS
缓冲液
[0013]通过电子秤称取
NaCl、KH2P04和
Na2HP04·
12H
20至定量容器中，再加入蒸馏水至定量容器中，定容得到
PBS
缓冲液，将配制好的
PBS
缓冲液加入高压灭菌容器中进行高压灭菌，将灭菌后的
PBS
缓冲液装入保温容器中保存；
[0014]S5
：无菌混合灌装
[0015]将分装好的稳定剂在
2℃
‑
4℃
的条件下融化，再将细胞外冻存保护剂
、
细胞内冻存保护剂
、
稳定剂和
PBS
缓冲液按体积比为
(5
‑
6)
：
(2
‑
3)
：
(1
‑
2)
：
(2
‑
3)
进行无菌混合灌装，得到冻存液，羟乙基淀粉最终浓度为5％
‑7％，脯氨酸最终浓度为4％～
4.4
％，甲基纤维素最终浓度为1％
‑
1.2
％
。
[0016]进一步地，步骤
S1
制备细胞外冻存保护剂，具体包括以下步骤：
[0017]S1.1
：将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，得到浓度为
10
％～
14
％的羟乙基淀粉溶液；
[0018]S1.2
：通过
0.20
‑
0.22
μ
m
无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂
。
[0019]进一步地，步骤
S3
制备稳定剂，具体包括以下步骤：
[0020]S3.1
：将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置对甲基纤维素进行加热，通过紫外线灯对甲基纤维素进行灭菌消毒；
[0021]S3.2
：灭菌后的甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容器内的甲基纤维素冷却至
37℃
‑
38℃
，加入无血清培养基后，甲基纤维素的浓度为5％
‑6％，通过搅拌器将甲基纤维素搅拌均匀，将装有甲基纤维素的搅拌容器放入冷冻装置内，在
‑
22℃
～
‑
20℃
的条件下放置
12h
‑
14h
；
[0022]S3.3
：将搅拌容器放在水浴装置中，使甲基纤维素和培养基在
2℃
‑
4℃
的条件下融化，得到稳定剂；
[0023]S3.4
：通过无菌分装设备将稳定剂装入分装容器中，通过冷冻装置使分装好的稳定剂在
‑
22℃
～
‑
20℃
条件下储存
。
[0024]进一步地，步骤
S4
制备
PBS
缓冲溶液，具体包括以下步骤：
[0025]S4.1
：通过电子秤称取
NaCl、KH2P04和
Na2HP04·
12H
20至定量容器中，再加入蒸馏水至定量容器中，定容得到
PBS
缓冲液，
PBS
缓冲液中
NaCl、KH2P04和
Na2HP04·
12H
20的质量比例为
(8.9
‑
9)
：
(0.14
‑
0.15)
：
(2
‑
2.1)
；
[0026]S4.2
：将配制好的
PBS
缓冲液加入高压灭菌容器中，对
PBS
溶液进行高压灭菌，灭菌温度为
121℃
‑
122℃
，计时器计时，高压灭菌
15
‑
20min
后，在
4℃
‑
6℃
条件下将灭菌后的
PBS
缓冲液装入保温容器中保存
。
[0027]进一步地，在进行步骤
S3.3
通过水浴装置将搅拌容器的温度保持在
2℃
‑
4℃
时，此时可以同步进行步骤
S4.2
，将步骤...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1
：制备细胞外冻存保护剂将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，通过无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂；
S2
：制备细胞内冻存保护剂将脯氨酸加入无血清培养基中，得到浓度为
20
％～
22
％的脯氨酸溶液，通过
0.20
‑
0.22
μ
m
无菌滤膜对脯氨酸溶液进行过滤除菌，即细胞内冻存保护剂；
S3
：制备稳定剂将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置加热，通过紫外线灯进行灭菌消毒，甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容器内的甲基纤维素冷却，加入无血清培养基后，通过搅拌器将甲基纤维素搅拌均匀，将搅拌容器放入冷冻装置内保存，通过水浴装置使甲基纤维素溶液融化，得到稳定剂，通过无菌分装设备将稳定剂装入分装容器中，通过冷冻装置对分装好的稳定剂进行储存；
S4
：制备
PBS
缓冲液通过电子秤称取
NaCl、KH2P04
和
Na2HP04
·
12H20
至定量容器中，再加入蒸馏水至定量容器中，定容得到
PBS
缓冲液，将配制好的
PBS
缓冲液加入高压灭菌容器中进行高压灭菌，将灭菌后的
PBS
缓冲液装入保温容器中保存；
S5
：无菌混合灌装将分装好的稳定剂在
2℃
‑
4℃
的条件下融化，再将细胞外冻存保护剂
、
细胞内冻存保护剂
、
稳定剂和
PBS
缓冲液按体积比为
(5
‑
6)
：
(2
‑
3)
：
(1
‑
2)
：
(2
‑
3)
进行无菌混合灌装，得到冻存液，羟乙基淀粉最终浓度为5％
‑7％，脯氨酸最终浓度为4％～
4.4
％，甲基纤维素最终浓度为1％
‑
1.2
％
。2.
根据权利要求1所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，所述步骤
S1
制备细胞外冻存保护剂，具体包括以下步骤：
S1.1
：将羟乙基淀粉加入无血清培养基中，得到浓度为
10
％～
14
％的羟乙基淀粉溶液；
S1.2
：通过
0.20
‑
0.22
μ
m
无菌滤膜对羟乙基淀粉溶液进行过滤除菌，得到细胞外冻存保护剂
。3.
根据权利要求1所述的一种提高干细胞存活率的冻存液制备工艺，其特征在于，所述步骤
S3
制备稳定剂，具体包括以下步骤：
S3.1
：将甲基纤维素加入消毒容器中，通过加热装置对甲基纤维素进行加热，通过紫外线灯对甲基纤维素进行灭菌消毒；
S3.2
：灭菌后的甲基纤维素通过无菌管道进入搅拌容器中，通过冰水浴使搅拌容...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩之海，王家伦，张磊升，曹俊宇，程翀，余桃英，
申请(专利权)人：江西汉氏联合干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：