基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法技术

本公开涉及基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法，所述方法包括：(1)构建得到稳定表达FSHR

【技术实现步骤摘要】
基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法


[0001]本公开主要涉及生物检测领域，具体涉及一种基于细胞中cAMP含量的FSH生物学活性体外测定方法。

技术介绍

[0002]促卵泡激素(Follicle
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stimulating hormone，FSH)又称卵泡刺激素，促卵泡生成素，是一种糖蛋白，由脑垂体合成并分泌的激素。FSH分子是由非共价键结合的α亚基和β亚基两个亚基所组成的异二聚体。在同一物种中，FSH与其它糖蛋白激素如促黄体生成素(Luteinizing Hormone，LH)、促甲状腺素(Thyroid Stimulating Hormone，TSH)等的α亚基的氨基酸序列相同，由92
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96个氨基酸组成(不同哺乳动物组成不同)。FSHβ亚基基因由109
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115个氨基酸组成，决定了FSH的生物学特异性，单独的α和β亚基都不具有生物学活性，只有在二者结合的情况下才能发挥生物学作用。
[0003]在女性中，FSH的功能是促进卵泡发育和成熟，及协同促黄体生成素(LH)促使发育成熟的卵泡分泌雌激素和排卵，参与正常月经的形成。FSH能够促进卵泡的发育和成熟，如果FSH水平低于正常值，可能患有多囊性卵巢综合征等疾病。在畜牧业中，FSH常应用于动物超数排卵、体外受精等，并且与动物产仔关系密切。
[0004]生物活性测定是表征产品分子结构与功能正确性，产品有效性的重要指标。截止到2021年，大鼠卵巢增重法仍是唯一被国内外监管机构批准和认可的FSH体内活性测定方法。但动物实验存在个体差异大，实验周期长，变异性大，活性变化敏感度低，操作要求高等缺点，制约了其在研发过程中的运用。随着国际上对动物福利的重视，在药物研发的活性评价领域大力开发动物实验替代方法已成共识，基于细胞的体外生物活性分析法已广泛用于单克隆抗体、重组细胞因子类制品的评价和放行检验。这几年来，报告基因法在我国生物技术药物体外细胞活性测定领域崭露头角，已逐渐成为平台化技术，报告基因法检测Ⅰ型干扰素生物学活性被纳入2015年版《中华人民共和国药典》，另外还有多种生物制品成功将报告基因法开发成为生物学活性放行方法。
[0005]利用CHO细胞构建人源报告基因细胞系已很常见，但表达猪源基因存在不确定性，CHO
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K1细胞系上不确定猪源FSHR是否能表达，且存在表达水平不高的问题，导致其存在筛选上的困难。因此，当前急需开发一种无需利用实验动物的、体外的高精度猪源FSH生物学活性检测方法。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种测定FSH生物学活性的方法，其利用p2A连接pFSHR和报告基因(例如eGFP)并将其在细胞(例如CHO
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K1细胞系)中表达，该细胞为首创的猪源FSHR报告基因细胞系，在2A肽剪切后，细胞中的荧光能良好表达，利于筛选，方便应用于重组pFSH融合蛋白体外生物学活性的检测。
[0007]本公开提供了一种测定FSH生物学活性的方法，所述方法包括：
[0008](1)构建得到稳定表达FSHR
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荧光蛋白报告基因的效应细胞；
[0009](2)培养效应细胞，然后加入FSH蛋白样品并继续培养；
[0010](3)将细胞裂解后，根据测定的细胞裂解液中的cAMP含量进行拟合以确定FSH生物学活性；
[0011]优选地，所述拟合为四参数拟合。
[0012]2A肽是来源于病毒的短肽(18
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25个氨基酸)，它们通常被称为“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通过使核糖体跳过2A元件C
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末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。目前有四种常用的2A肽，分别是P2A，T2A，E2A和F2A，来源于四种不同的病毒。在四种常用的2A肽(P2A，T2A，E2A和F2A)中，P2A通常具有最高的切割效率(在某些情况下接近100％)，接下来是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为约50％，通常推荐在多顺反子中使用P2A或T2A。在2A肽的上游或下游插入信号肽基因序列，可使目的基因在翻译后定位到细胞核、叶绿体、线粒体、膜或胞质微管等。自剪切2A肽在生物显像术领域中有重要应用。将目的基因与荧光蛋白通过2A肽相连，可以根据荧光蛋白表达与否来初步判断目的基因的表达情况。
[0013]FSHR(FSH受体)属于G蛋白偶联受体(GPCRs)的一个结构独特的糖蛋白激素受体亚家族，具有异常长的胞外结构域(ECD)、七个跨膜结构域、三个短胞内环、三个胞外环和一条胞内尾巴(Jiang et al.，2012)。根据手扣模型，二聚体FSH结合到FSHR的外域，触发FSHR的构象变化，随后激活G蛋白和腺苷酸环化酶，导致环磷酸腺苷(cAMP)的生成增加。
[0014]本公开将pig FSHR与eGFP基因中插入P2A序列，在翻译过程中，P2A发生“自裂解”，产生两个蛋白，pig FSHR会定位在细胞膜上，而eGFP蛋白会在细胞质中，用荧光显微镜观察到有绿色荧光，说明pig FSHR也同时得到表达。为了评估猪源FSH在体外的生物活性，本公开构建了猪源FSH受体(FSHR)的CHO细胞，用不同FSH样品来刺激，通过竞争ELISA的方法测定cAMP水平用来得到不同FSH的cAMP含量，并通过参比品与样品的比较来得到相对的生物活性水平。
附图说明
[0015]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本说明书的实施例，并与说明书一起用于解释本说明书的原理。
[0016]图1示出了FSHR
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eGFP报告基因的基因序列设计；其中图(A)示出了报告基因表达后的断裂位点，图(B)示出了P2A蛋白的氨基酸序列。
[0017]图2示出了G418加压筛选CHO
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K1细胞株的VIA变化。其中，“w/o G418”为正常细胞对照组；“Pig FSHR
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GFP”为转染筛选组；“With G418”为阴性对照组。
[0018]图3示出了荧光显微镜下观察到的转入Pig
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FSHR
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eGFP融合基因的CHO
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K1细胞和未转入Pig
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FSHR
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eGFP融合基因的CHO
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K1细胞；其中左图为CHO
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K1
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Pig
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FSHR
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eGFP细胞，右图为CHO
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K1细胞。
[0019]图4示出了荧光克隆阳性的CHO
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K1
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Pig
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FSHR
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定FSH生物学活性的方法，所述方法包括：(1)构建得到稳定表达FSHR
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报告基因的效应细胞；优选地，所述报告基因为荧光蛋白报告基因；(2)培养效应细胞，然后加入FSH蛋白样品并继续培养；(3)将细胞裂解后，根据测定的细胞裂解液中的cAMP含量进行拟合以确定FSH生物学活性；优选地，所述拟合为四参数拟合。2.权利要求1所述的方法，其中所述FSHR
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荧光蛋白报告基因为将目的基因FSHR与荧光蛋白基因之间插入2A肽序列形成的报告基因；优选地，所述荧光蛋白选自eGFP、GFP、mWasabi、AcGFP、EBFP、EBFP2、mtagBFP、ECFP、EYFP、venus、tdTomato或TagRFP；更优选地，所述荧光蛋白为eGFP；优选地，所述荧光蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3或其任何变体所示；优选地，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或其任何变体所示；更优选地，所述报告基因的核酸序列如SEQ ID NO:4或其任何变体所示；更优选地，所述报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或其任何变体所示。3.权利要求2所述的方法，其中所述2A肽选自P2A、T2A、E2A或F2A中的任一种；更优选地，所述2A肽为P2A；优选地，所述2A肽的核酸序列如SEQ ID NO:2或其任何变体所示；优选地，所述2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或其任何变体所示。4.权利要求1
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3任一项所述的方法，所述FSHR基因为猪FSHR；优选地，所述猪FSHR的核酸序列如SEQ ID NO:1或其任何变体所示；优选地，所述猪FSHR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或其任何变体所示。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：梅彩英，周立明，曹锴，吕洁婷，王爱珂，陈璐，范禄同，
申请(专利权)人：宁波三生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：