用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术属于中药鉴定技术领域，涉及威灵仙的鉴定，具体涉及用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用


[0001]本专利技术属于中药鉴定
，涉及威灵仙的鉴定，具体涉及用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用
。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术
。
[0003]威灵仙为毛茛科植物威灵仙
Clematis chinensis Osbeck、
棉团铁线莲
Clematis hexapetala Pall.
或东北铁线莲
Clematis manshuricaRupr.
的干燥根和根茎
。
具有祛风除湿
、
通络止痛
、
消骨鲠等功效
。
目前威灵仙市场品种混杂，常规鉴定方法无法有效区分药材真伪
。
[0004]DNA
条形码技术因其具有较强的通用性以及鉴定结果可重复性的优点，因而被广泛应用于中药材的鉴定中
。DNA
条形码主要是利用基因组中相对较短的
DNA
片段进行药材物种进行鉴别的手段
。
通过此种方法能建立
DNA
条形码数据库以及鉴定平台，实现药材正品与伪劣品的鉴别
。
分子鉴定通常的鉴定方法为测序后，采用相似性搜索法和建树法利用相关软件对大量序列进行运算后实现对样本的准确鉴定，由于样本
、
序列数据库不全面
、
参比序列经常变化等问题的存在，使得分子鉴定的鉴定指标不够明确
。
经专利技术人研究了解，核基因分子标记
ITS2
可鉴定威灵仙正品与混伪品，但不能区分三个正品基原
。

技术实现思路

[0005]在大多数被子植物中，母系遗传的叶绿体基因组具有高度保守
、
非编码区进化速度快等特点，而且叶绿体基因组非编码区中的基因间区具有丰富的遗传变异，叶绿体基因单倍型可直接用于植物遗传多样性检测，发掘多组专属性引物组，能够实现威灵仙的正伪区分，甚至能够实现不同正品威灵仙间的区分
。
基于上述研究成果，本专利技术提供了用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用
。
[0006]具体地，本专利技术的技术方案为：
[0007]一方面，一种用于鉴别威灵仙的引物组，选自以下至少一对引物组：
[0008]ITS2F/ITS3R
引物组，
WLX2F/WLX1R
引物组，
WLXZF/WLXZR
引物组；
[0009]ITS2F
的序列如
SEQ ID NO.1
所示，
ITS3R
的序列如
SEQ ID NO.2
所示，
WLX2F
的序列如
SEQ ID NO.3
，
WLX1R
的序列如
SEQ ID NO.4
所示的引物组，
WLXZF
的序列如
SEQ ID NO.5
，
WLXZR
的序列如
SEQ ID NO.6
所示的引物组
。
[0010]本专利技术首先使用
ITS2
的引物组
ITS2F/ITS3
进行
PCR
扩增对威灵仙进行鉴定，发现该引物组，能够对威灵仙的正伪进行区分，且能够对少数威灵仙的物种进行鉴别
。
然后，本专利技术在
ccsA
区域设计了
WLX2F/WLX1R
引物组，该引物组能够区分威灵仙的正伪；在
ND5
区域设计了
WLXZF/WLXZR
引物组，该引物组能够区分正品基原；通过
WLX2F/WLX1R
引物组和
WLXZF/WLXZR
引物组的结合，能够有效实现对威灵仙的正品基原进行鉴定
。
[0011]另一方面，一种上述用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用
。
[0012]第三方面，一种用于鉴别威灵仙的检测试剂，包括上述用于鉴别威灵仙的引物组以及溶剂
。
[0013]第四方面，一种用于鉴别威灵仙的检测试剂盒，包括上述用于鉴别威灵仙的引物组
、
溶剂以及植物基因组
DNA
提取试剂
。
[0014]本专利技术的有益效果为：
[0015]本专利技术对提供的
ITS2F/ITS3R
引物组，通过构建
NJ
树发现其可以区分威灵仙的正伪，通过对8份威灵仙样品的
Sanger
测序表明，有6份可以鉴定为威灵仙正品，剩余两份甚至可以被鉴定到物种
。
[0016]本专利技术对提供的
WLX2F/WLX1R
引物组和
WLXZF/WLXZR
引物组的研究表明，其不易产生二聚体及发夹结构，适合对威灵仙及混伪品进行扩增，并通过
WLX2F/WLX1R
引物组对威灵仙正伪进行鉴定以及
WLXZF/WLXZR
引物组对威灵仙正品基原进行鉴定的协同，实现对未知威灵仙的正品基原的鉴定
。
附图说明
[0017]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定
。
[0018]图1为本专利技术实施例1中
ITS2
系统发育树，标红的的为威灵仙正品基原；
[0019]图2为本专利技术实施例1中正品威灵仙的叶绿体全基因组图谱；
[0020]图3为本专利技术实施例1中正品棉团铁线莲的叶绿体全基因组图谱；
[0021]图4为本专利技术实施例1中显脉旋覆花的叶绿体全基因组图；
[0022]图5为本专利技术实施例1中叶绿体共有蛋白编码区
NJ
树；
[0023]图6为本专利技术实施例2中批威灵仙饮片的物种组成热图，
A
为区分正伪基原的引物对得到的物种组成热图，
B
为区分三个正品基原的引物对得到的物种组成热图，
ZP
代表正品威灵仙，
UN
代表未知物种
。
具体实施方式
[0024]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明
。
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义
。
[0025]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于鉴别威灵仙的引物组，其特征是，选自以下至少一对引物组：
ITS2F/ITS3R
引物组
、WLX2F/WLX1R
引物组
、WLXZF/WLXZR
引物组；
ITS2F
的序列如
SEQ ID NO.1
所示，
ITS3R
的序列如
SEQ ID NO.2
所示，
WLX2F
的序列如
SEQ ID NO.3
，
WLX1R
的序列如
SEQ ID NO.4
所示的引物组，
WLXZF
的序列如
SEQ ID NO.5
，
WLXZR
的序列如
SEQ ID NO.6
所示的引物组
。2.
如权利要求1所述的用于鉴别威灵仙的引物组，其特征是，其为
WLX2F/WLX1R
引物组与
WLXZF/WLXZR
引物组的组合
。3.
一种权利要求1或2所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用
。4.
如权利要求3所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用，其特征是，采用
ITS2F/ITS3R
引物组待测样本
DNA
进行
PCR
扩增获得扩增片段，利用扩增片段对待测样本进行威灵仙正伪的区分；对区分后的正品
DNA
进行叶绿体基因组测序
、
组装和结构解析，将叶绿体全基因组作为超级条形码区分威灵仙的正品基原
。5.
如权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周书繁，张思聪，王辉，杨玉，苑鹏翀，汪巍，
申请(专利权)人：辽宁上药好护士药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：