一种制造技术

本发明专利技术属于基因敲除技术领域，具体涉及一种

【技术实现步骤摘要】
一种sgRNA组合及其应用、斑马鱼Adcyap1b基因突变体模型及其构建方法


[0001]本专利技术属于基因敲除
，具体涉及一种
sgRNA
组合及其应用
、
斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型及其构建方法
。

技术介绍

[0002]垂体腺苷酸环化酶激活肽
(pituitary adenylate cyclase
‑
activating polypeptide,PACAP)
是一种多功能蛋白，具有氨基酸序列的神经肽；从绵羊的下丘脑被首次纯化得到，在脊椎动物中保守性良好
。PACAP
也是血管活性肠肽
(vasoactive intestinal peptide,VIP)/
分泌素
/
胰高血糖素超家族的一员，在许多组织和器官中起到生物学功能，其中的生物学功能包括血管生成能力和血管平滑肌松弛
。PACAP
的作用是通过特异性的
PAC1
受体
(PAC1R)
和
VPAC2
受体
(VPAC1R
和
VPAC2R)
，所有受体都属于
G
蛋白偶联受体
(
分泌素受体家庭
)。PACAP
亚型及其受体主要在中枢神经系统和周围组织器官，包括血管中表达
。PACAP
对血管系统有很强的作用，能诱导血管松弛和引起局部和全身血压下降
。
已在多种动物模型中证明其血管系统的作用，如小鼠
、
大鼠
、
猫
、
狗
、
猪和人
。
研究还发现，
PACAP
神经肽家族在人的胚胎期参与调控血液流动和激素分泌，并可刺激血管内皮生长因子
(vascular endothelial growth factor,VEGF)
的释放，调控胚胎的发育过程
。PACAP
与
VEGF
信号系统存在着交叉对话
(crosstalk)
，有助于
PACAP
的促血管生成和抗凋亡作用
。
[0003]在斑马鱼体内，
PACAP
基因
(adcyap1)
被复制生成
adcyap1a(
编码
Adcyap1a
，也称
PACAP1)
和
adcyap1b(
编码
Adcyap1b
，也称
PACAP2)。Adcyap1b
蛋白与另一个亚型
Adcyap1a
在眼睛
、
感受器官和神经系统发育过程中被上调
。
它的3个受体
Adcyap1r1、Vipr1
和
Vipr2
在斑马鱼的中枢神经系统和多种外周组织均有表达
。Tomoya
等研究了
adcyap1b
的
mRNA
在斑马鱼脑部表达的分布，其主要在端脑表达，其次是间脑
。
关于
adcyap1b
基因在鱼类血管发育过程中的生理功能和作用机制的研究还相对缺乏
。
通过构建突变体模型，考察
adcyap1b
基因在斑马鱼胚胎
/
幼体血管生成中的作用及该作用在药物导致机体出血中的影响
。
[0004]目前
Adcyap1b
基因在斑马鱼中的作用研究主要方法是吗啉代修饰的反义寡核苷酸技术
(Morpholino)
介导的基因敲降方法
。
该技术方法虽然可快速研究目的基因功能，但也存在缺点，即该技术在
mRNA
水平减低基因表达，仍有基因表达产物发挥作用，某些特殊的表型不易被观察；再者该技术只能短期降低斑马鱼体内目的基因的表达，无法实现长期观察由于基因表达缺失造成的功能障碍；此外，该方法利用不当会导致
P53
表达升高，诱发非特异性的细胞凋亡，产生的表型易与凋亡相关表型混淆，影响基因功能研究，现有技术中并未有关于构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体的记载
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，特异性敲除斑马鱼
Adcyap1b
基因，选育出
Adcyap1b
基因缺失型斑马鱼，构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型
。
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种
sgRNA
组合，包括
sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3
和
sgRNA4
；所述
sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3
和
sgRNA4
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.1
至
SEQ ID NO.4
所示
。
[0007]本专利技术还提供了上述技术方案所述的
sgRNA
组合在构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型中的应用
。
[0008]本专利技术还提供了一种斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型，利用上述技术方案所述的
sgRNA
组合构建得到
。
[0009]本专利技术还提供了一种构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型的试剂盒，包括上述技术方案所述的
sgRNA
组合
。
[0010]优选的，还包括
Cas9
蛋白
。
[0011]本专利技术还提供了一种斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型的构建方法，包括如下步骤：
[0012]将上述技术方案所述的
sgRNA
组合和
Cas9
蛋白的混合物注射到斑马鱼的受精卵中，选出有效敲除的胚胎，培养至成鱼，获得
F0
代突变斑马鱼；
[0013]将所述
F0
代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到
F1
代胚胎，筛选所述
F1
代胚胎中存在突变的胚胎，培养至成鱼，得到可遗传的斑马鱼突变体
。
[0014]优选的，所述
sgRNA
组合和
Cas9
蛋白混合物中
sgRNA
组合的浓度为
200ng/
μ
L
，
Cas9
蛋白的浓度为
400ng/
μ
L。
[0015]优选的，选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
sgRNA
组合，其特征在于，所述
sgRNA
组合包括
sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3
和
sgRNA4
；所述
sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3
和
sgRNA4
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.1
至
SEQ ID NO.4
所示
。2.
权利要求1所述的
sgRNA
组合在构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型中的应用
。3.
一种斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型，其特征在于，利用权利要求1所述的
sgRNA
组合构建得到
。4.
一种构建斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的
sgRNA
组合
。5.
根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括
Cas9
蛋白
。6.
一种斑马鱼
Adcyap1b
基因突变体模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的
sgRNA
组合和
Cas9
蛋白的混合物注射到斑马鱼的受精卵中，选出有效敲除的胚胎，培养至成鱼，获得
F0
代突变斑马鱼；将所述
F0
代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到
F1
代胚胎，筛选所述
F1
代胚胎存在突变的胚胎，培养至成鱼，得到斑马鱼
Adcyap1b<...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩莹，张靖溥，国瑞贤，马媛媛，陈博，张苗青，刘馨妍，张锐，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：