一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的应用制造技术

本发明专利技术公开一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的应用，属于生物医学技术领域，包括一种检测方法，检测包括hspa12b在小鼠酒精性肝病肝脏组织的表达变化，hspa12b基因敲除小鼠炎症，凋亡的改变，肝脏组织中内质网应激相关分子ATF4，CHOP蛋白表达变化，hspa12b基因敲低和肝脏特异性过表达hspa12b基因对酒精性肝病小鼠的肝功能改变。本发明专利技术检测方法操作简单快速、稳定性好，为酒精性肝病患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的应用。

技术介绍

[0002]酒精依赖和酒精过度摄入是全世界范围内的公共卫生问题，据统计，酗酒是世界第二大疾病和致残风险。关于中国人饮酒的流行病学调查中观察到，2005年至2018年，中国人均酒精消费量增长80％，酒精性肝损伤的发病率日益升高，已超过病毒性肝炎成为肝损伤的首要病因。目前临床上酒精性肝病的治疗措施主要包括戒酒，补充营养，抗氧化、抗炎等药物治疗，但效果不佳。迄今为止，仍缺乏有效治疗方法，因此，寻找新的有效的蛋白分子作为酒精性肝病治疗的干预靶点具有重要意义。
[0003]热休克蛋白(HSPs)是在几乎所有物种中均存在的进化上高度保守的蛋白质，作为分子伴侣在细胞周期调控、细胞信号转导、细胞结构维持等多种生命活动中发挥重要作用。HSP70是HSPs家族中最保守、含量最丰富、最重要的一类，正常情况下在细胞内呈基础表达，当机体受到有害刺激时，HSP70表达迅速增加，修复蛋白质损伤，抑制细胞损伤通路。常见肝脏疾病患者血清HSP70水平有明显升高。热休克蛋白A12B(HSPA12B)是HSP70家族的新成员。后续研究证实，HSPA12B参与调控内皮细胞的迁移、增殖和血管新生。内皮细胞损伤模型中，HSPA12B表达有明显升高，过表达HSPA12B可以通过抑制内皮细胞的炎症反应，减轻血管内皮功能损伤，发挥心血管保护作用。
[0004]近期我们发现，野生型小鼠酒精饲料喂养后肝脏组织中hspa12b表达升高；hspa12b基因敲除小鼠较野生型小鼠肝脏炎症反应和肝细胞凋亡加重，其肝脏组织中内质网应激相关基因ATF4、CHOP表达升高。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的应用，包括一种检测方法，检测包括hspa12b在酒精性肝病小鼠肝脏组织中的表达变化，hspa12b基因敲除小鼠肝脏炎症反应和凋亡的改变，肝脏组织中内质网应激相关基因ATF4、CHOP表达变化，以及hspa12b基因敲除和肝脏过表达hspa12b基因对酒精性肝病小鼠肝功能改变的影响。本专利技术检测方法通过提取酒精性肝病模型小鼠肝脏组织的RNA检测hspa12b的表达水平；利用hspa12b敲基因小鼠提取敲除小鼠肝脏组织RNA，检测炎症反应，凋亡mRNA水平，以及内质网应激基因ATF4，CHOP蛋白改变；敲除hspa12b小鼠和肝脏特异性过表达hspa12b小鼠肝功能相关指标的检测。操作简单快速、稳定性好；为酒精性肝病患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种酒精性肝病治疗靶点，所述酒精性肝病治疗靶点为hspa12b。
[0008]一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的检测方法，所述检测方法包括检测
hspa12b在酒精性肝病小鼠肝脏组织中的表达变化、hspa12b基因敲除小鼠肝脏炎症反应和凋亡的改变、肝脏组织中内质网应激相关基因ATF4、CHOP表达变化以及hspa12b基因敲除和肝脏特异性过表达hspa12b对酒精性肝病小鼠肝功能改变的影响；
[0009]所述hspa12b在酒精性肝病小鼠肝脏组织中的表达变化的检测方法包括：
[0010]提取对照饮食和酒精饮食的野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算hspa12b的相对定量值；
[0011]所述肝脏组织炎症反应改变的检测方法包括：
[0012]分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，计算炎症因子TNF
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α、IL
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1β、IL
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6的相对定量值，计算两种基因型小鼠肝脏组织中上述炎症基因的表达差异；
[0013]所述肝脏组织凋亡反应改变的检测方法包括：
[0014]分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，计算凋亡因子Bax、Bcl
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2、caspase
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3的相对定量值；
[0015]所述所述肝脏组织内质网应激相关基因检测方法包括：
[0016]分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总蛋白；BCA法检测蛋白浓度，调平浓度，蛋白免疫印迹,曝光，显影，计算内质网应激基因ATF4、CHOP、内参GAPDH的灰度相对定量值，计算两种基因型小鼠肝脏组织中上述基因的表达差异；
[0017]所述不同基因型小鼠肝功能检测方法包括：
[0018]野生型小鼠，hspa12b敲除小鼠以及肝脏特异性过表达hspa12b小鼠麻醉，分别眼眶采血，离心后，取上清，利用ALT，AST检测试剂盒检测各组小鼠血清中含量，计算不同基因型小鼠血清中ALT，AST的表达差异。
[0019]进一步的，在所述hspa12b在酒精性肝病小鼠的肝脏组织中表达检测中，所述试剂包括第一实时荧光定量PCR检测试剂，第一实时荧光定量PCR检测试剂包括hspa12b的特异性引物和内参照18S的特异性引物。。
[0020]进一步的，所述hspa12b的特异性引物包括hspa12b的特异性正向引物和hspa12b的特异性反向引物。
[0021]进一步的，所述肝脏组织炎症检测中所用试剂包括第二实时荧光定量PCR检测试剂，第二实时荧光定量PCR检测试剂包括TNF
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α的特异性引物、IL
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1β的特异性引物、IL
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6的特异性引物和内参照18S的特异性引物。
[0022]进一步的，所述TNF
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α的特异性引物包括TNF
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α的特异性正向引物和TNF
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α的特异性反向引物，IL
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1β的特异性引物包括IL
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1β的特异性正向引物和IL
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1β的特异性反向引物；IL
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6的特异性引物包括IL
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6的特异性正向引物和IL
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6的特异性反向引物。
[0023]进一步的，所述肝脏组织凋亡反应改变的检测中，所用试剂包括第三实时荧光定量PCR检测试剂，所述第二实时荧光定量PCR检测试剂包括Bax的特异性引物、Bcl
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2的特异性引物、Caspase
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3的特异性引物和内参照18S的特异性引物。
[0024]进一步的，所述所述Bax的特异性引物包括Bax的特异性正向引物和Bax的特异性反向引物，Bcl...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酒精性肝病治疗靶点，其特征在于，所述酒精性肝病治疗靶点为hspa12b。2.一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括检测hspa12b在酒精性肝病小鼠肝脏组织中的表达变化、hspa12b基因敲除小鼠肝脏炎症反应和凋亡的改变、肝脏组织中内质网应激相关基因ATF4、CHOP表达变化以及hspa12b基因敲除和过表达对酒精性肝病小鼠肝功能改变的影响；所述hspa12b在酒精性肝病小鼠肝脏组织中的表达变化的检测方法包括：提取对照饮食和酒精饮食的野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算hspa12b的相对定量值；所述肝脏组织炎症反应改变的检测方法包括：分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，计算炎症因子TNF
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α、IL
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1β、IL
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6的相对定量值，计算两种基因型小鼠肝脏组织中上述炎症基因的表达差异；所述肝脏组织凋亡反应改变的检测方法包括：分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总RNA，RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，计算凋亡因子Bax、Bcl
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2、caspase
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3的相对定量值；所述所述肝脏组织内质网应激相关基因检测方法包括：分别取hspa12b敲除小鼠和野生型小鼠肝脏组织，提取肝脏组织总蛋白；BCA法检测蛋白浓度，调平浓度，蛋白免疫印迹,曝光，显影，计算内质网应激基因ATF4、CHOP、内参GAPDH的灰度相对定量值，计算两种基因型小鼠肝脏组织中上述基因的表达差异；所述不同基因型小鼠肝功能检测方法包括：野生型小鼠，hspa12b敲除小鼠以及肝脏特异性过表达hspa12b小鼠麻醉，分别眼眶采血，离心后，取上清，利用ALT，AST检测试剂盒检测各组小鼠血清中含量，计算不同基因型小鼠血清中ALT，AST的表达差异。3.根据权利要求2所述的一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的检测方法，其特征在于，在所述hspa12b在酒精性肝病小鼠的肝脏组织中表达检测中，所述试剂包括第一实时荧光定量PCR检测试剂，第一实时荧光定量PCR检测试剂包括hspa12b的特异性引物和内参照18S的特异性引物。4.根据权利要求3所述的一种以hspa12b作为酒精性肝病治疗靶点的检测方法，其特征在于，所述hspa1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，焦新峰，刘嘉莉，沈茜煜，
申请(专利权)人：东南大学附属中大医院，
类型：发明
国别省市：