用于识别早期神经发育毒性的生物标志物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了三个生物标志物以灵敏、快速识别新型化合物的早期神经发育的毒性作用，本发明专利技术还涉及了鉴别神经发育毒性的评分方法，为高通量筛选药物、新型化合物对神经发育的不良影响提供快速、精准的响应模型和鉴别指南。精准的响应模型和鉴别指南。

【技术实现步骤摘要】
用于识别早期神经发育毒性的生物标志物及其用途


[0001]本专利技术属于细胞生物学与毒理学交叉领域，具体涉及识别、预测、鉴定新型化合物的早期神经发育毒性的生物标志物及其用途。本专利技术还提供判断新型化合物早期神经发育毒性作用强弱的评分方法。

技术介绍

[0002]过去的几十年里，人工合成的新型化合物的种类和数量呈指数型爆炸增长，这些化合物通常在没有进行详尽评估和完善监管的情况下被大量生产并投入使用，它们随着工业生产和作为消费品使用被广泛释放到环境中。这些新型化合物广泛赋存于环境中，并导致了持续的人体暴露，这些新型化合物的潜在神经毒性及其与神经系统疾病的关联更是引起了广泛的担忧。特别是胎儿早期的神经发育具有高度可塑性，发育敏感窗口期的微弱扰动就可能干扰神经系统发育路径，并可能对胎儿造成终身影响。传统的毒性评估方法需要暴露于实验动物或癌细胞模型，耗费时间和金钱，而且难以将实验结果外推为人类暴露风险的准确预测。此外，一些化合物可能不表现出典型的毒性反应，需要更灵敏、更精确、更特异的评估方法来识别神经发育风险。生物标志物是对某些生物学过程、分子、细胞等的响应，可以被用来反映生物体对某种化学物质的暴露和影响。使用生物标志物来识别神经发育毒性可以更加准确地识别化学物质对婴儿和儿童神经系统发育的影响，提高评估的准确性。通过识别神经发育早期关键的生物标志物，实现新型化合物神经发育毒性预警、快速识别以及评估将有助于建立新型化合物高通量筛选平台，为人体健康风险评估以及疾病预防提供有效的平台支撑。
[0003]人的神经系统从胚胎发育早期的神经外胚层发育而来。目前，识别早期神经外胚层发育中的有效生物标志物用于新型化合物神经发育毒性筛查仍是空白，亟需筛选出高灵敏、高响应的生物标志物应用于神经发育毒性的识别、鉴定。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供用于新型化合物神经发育毒性识别、预警和评估的生物标志物，通过检测和定量生物样品中的这些生物标志物，从而对新型化合物的神经发育毒性进行筛查。
[0005]一方面，本专利技术提供检测和定量待测化合物的神经发育毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测生物标志物表达水平的试剂。
[0006]在一些实施方案中，所述试剂包括检测生物标志物表达水平的引物。
[0007]在一些实施方案中，所述试剂还包括检测生物标志物SOX1、SIX3、PAX6、NES、SOX3和OTX2中的一个或多个的表达水平的实时荧光定量PCR检测试剂。
[0008]在一些实施方案中，所述生物标志物包括SOX1、SIX3和PAX6中一个、两个或全部三个的组合和选自NES、SOX3和OTX2中零个、一个、两个或全部三个的组合。
[0009]在一些实施方案中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书指示一个或多个生物
标志物的表达水平异常升高或降低可能表明所述待测化合物具有神经发育毒性。
[0010]在一些实施方案中，所述试剂盒还包括诱导人诱导多能干细胞为神经外胚层、神经干细胞、神经祖细胞、神经元或胶质细胞的诱导培养基。
[0011]在一些实施方案中，所述试剂盒包括诱导所述人诱导多能干细胞为神经外胚层的培养基。
[0012]在一些实施方案中，所述诱导培养基包括DMEM/F
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12培养基、1
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200mg/L优选为64mg/L的抗坏血酸、1
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1000mg/L优选为543mg/L的碳酸氢钠、1
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50μg/L优选为14μg/L的亚硒酸钠、1
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50mg/L优选为19.4mg/L的胰岛素、1
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50mg/L优选为10.7mg/L的转铁蛋白。
[0013]另一方面，本专利技术提供上述试剂盒在检测和定量待测化合物的神经发育毒性中的用途。
[0014]另一方面，本专利技术提供检测和定量待测化合物的神经发育毒性的方法，所述方法包括：检测和定量经所述待测化合物处理的样品中的生物标志物的表达水平，所述生物标志物为SOX1、SIX3和PAX6中一个、两个或全部三个的组合和选自NES、SOX3和OTX2中零个、一个、两个或全部三个的组合。
[0015]在一些实施方案中，所述表达水平的测定方法包括实时荧光定量PCR、定量免疫细胞化学、质谱法、表面等离子共振和微阵列分析。
[0016]在一些实施方案中，对生物标志物的表达水平变化进行打分，假设经所述待测化合物处理的样品中的生物标志物的表达水平相对于未经所述待测化合物处理的样品中的生物标志物表达水平的倍数变化为FC，如果|Log
2 FC|<0.59，则判断所述待测化合物无显著神经发育毒性；如果0.59≤|Log
2 FC|<1.00，则判断所述待测化合物有轻微神经发育毒性；如果1.00≤|Log
2 FC|，则判断所述待测化合物有明显神经发育毒性。其中，所述生物标志物包括SOX1、SIX3和PAX6中一个、两个或全部三个的组合和选自NES、SOX3和OTX2中零个、一个、两个或全部三个的组合。
[0017]在一些实施方案中，生物标志物的表达水平的异常降低，表明神经发育毒性风险的增加。
[0018]在一些实施方案中，生物标志物的表达水平的异常升高，表明神经发育毒性风险的增加。
[0019]在一些实施方案中，所述待测化合物选自新烟碱类杀虫剂和有机磷酸酯阻燃剂。
[0020]在一些实施方案中，所述新烟碱类杀虫剂选自：啶虫脒、吡虫啉、氯噻啉和环氧虫啶。
[0021]在一些实施方案中，所述有机磷酸酯阻燃剂选自：磷酸三乙酯、磷酸三丁酯、磷酸三(2
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氯乙基)酯、磷酸三苯酯和磷酸三(1，3
‑
二氯异丙基)酯。
[0022]另一方面，本专利技术提供了检测和定量待测化合物的神经发育毒性的方法，所述方法包括：
[0023]在存在所述待测化合物暴露的情况下和在不存在所述待测化合物暴露的情况下诱导人多能干细胞分化为神经外胚层细胞；
[0024]测定在存在所述待测化合物暴露的情况下诱导的神经外胚层细胞中生物标志物的表达水平相对于在不存在所述待测化合物暴露的情况下诱导的神经外胚层细胞中生物标志物的表达水平的倍数改变FC，其中：
[0025]如果|Log
2 FC|<0.59，则判断所述待测化合物无显著神经发育毒性；
[0026]如果0.59≤|Log
2 FC|<1.00，则判断所述待测化合物有轻微神经发育毒性；
[0027]如果1.00≤|Log
2 FC|，则判断所述待测化合物有明显神经发育毒性；
[0028]其中，所述生物标志物包括SOX1、SIX3和PAX6中一个、两个或全部三个的组合和选自NES、SOX3和OTX2中零个、一个、两个或全部三个的组合。
[0029]本专利技术提供了一种诱导人多能干细胞分化为神经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测和定量待测化合物的神经发育毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测生物样品中生物标志物SOX1、SIX3、PAX6、NES、SOX3和OTX2中的一个或多个的表达水平的试剂，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书指示一个或多个生物标志物的表达水平异常升高或降低可能表明所述待测化合物具有神经发育毒性。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测生物标志物SOX1、SIX3、PAX6、NES、SOX3和OTX2中的一个或多个的表达水平的引物。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括检测生物标志物SOX1、SIX3、PAX6、NES、SOX3和OTX2中的一个或多个的表达水平的实时荧光定量PCR检测试剂。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样品是从人体样本中获得的神经外胚层细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经元或神经胶质细胞或组织，或是永生化细胞系或干细胞系的细胞培养物。5.检测生物样品中待测化合物的神经发育毒性的方法，其特征在于，所述方法包括：测定经所述待测化合物处理的样品中的生物标志物的表达水平，所述生物标志物为SOX1、SIX3和PAX6中一个、两个或全部三个的组合和选自NES、SOX3和OTX2中零个、一个、两个或全部三个的组合。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测化合物选自新烟碱类杀虫剂和有机磷酸酯阻燃剂，任选地，所述新烟碱类杀虫剂选自：啶虫脒、吡虫啉、氯噻啉和环氧虫啶，任选地，所述有机磷酸酯阻燃剂选自：磷酸三乙酯、磷酸三丁酯、磷酸三(2
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氯乙基)酯、磷酸三苯酯和磷酸三(1，3
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二氯异丙基)酯。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述表达水平的测定方法选自实时荧光定量PCR、定量免疫细胞化学、质...

【专利技术属性】
技术研发人员：李时畅，张淑娴，杨仁君，殷诺雅，费凡，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：