一种可用于活体的可视化神经环路的方法及工具病毒载体技术

本发明专利技术公开一种可用于活体的可视化神经环路的方法及工具病毒载体。本发明专利技术所述工具病毒载体为过表达酪氨酸酶(TYR)报道基因的神经环路示踪病毒载体，在局部脑区注射后能够通过神经环路在全脑的相连脑区驱动表达TYR报告基因，TYR能够在细胞中催化酪氨酸发生多步反应合成黑色素，使用靶向黑色素的核素标记探针穿透血脑屏障靶向黑色素能够实现全脑神经环路的活体可视化。该系统的构建为系列脑科学研究提供了一种强有力的研究工具。提供了一种强有力的研究工具。提供了一种强有力的研究工具。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于活体的可视化神经环路的方法及工具病毒载体


[0001]本专利技术属于核医学分子影像领域，具体而言，涉及一种可用于活体的可视化神经环路的方法及工具病毒载体。

技术介绍

[0002]神经元之间形成的复杂突触联系和神经网络是大脑神经功能的结构基础，鉴定和解析这些神经环路是现代神经科学的一大中心目标。神经环路示踪病毒是一类既能够感染神经细胞，又能沿着神经突触传播(部分可复制)并指示神经投射的工具病毒。基于病毒的经典神经环路示踪方法具有几大优势：(1)能够实现特定类型细胞的感染标记；(2)能够有效跨或不跨突触传播，传播方向更加可控；(3)可按需选择具备或不具备持续复制能力的病毒载体，信号获取更加稳定、不易衰减；但是，目前的工具病毒主要靠搭载荧光蛋白实现神经环路标记，受光学方法成像深度的天然限制，因此难以实现活体示踪。
[0003]影像学方法同样能够帮助解析神经环路。例如，正电子发射断层扫描(PET)是一种代表性的分子成像技术，能够在细胞和分子水平上对生物过程进行无创性的可视化、表征和量化。利用放射性标记的葡萄糖类似物
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氟
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氟代脱氧葡萄糖(
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F
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FDG)作为分子探针，PET能够基于神经活动的糖代谢增加的机理，利用特定脑区神经活动的增加或减少会使其自身和下游脑区的
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FDG摄取同步增加或减少的特性，帮助评估全脑代谢网络模式和潜在脑区连接。但是，影像学方法难以实现特定神经环路的连接评估(如
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FDG PET信号变化同样受多种外界因素影响)，也无法用于区分不同脑区之间的上下游关系(如下游脑区变化同样可导致上游脑区的代偿性变化)。
[0004]PET报告基因显像是一种间接成像策略，通过放射性示踪剂靶向在某一基因/蛋白启动子或增强子控制下表达的报告基因产物(通常为酶、转运体或受体)，可以实现同步表达的目标基因或蛋白的可视化评估，也能够用于间接反映报告基因所在细胞的位置和活性。酪氨酸酶(TYR)是一种调控黑色素生成的限速酶，其转染表达能够驱动细胞产生黑色素。借助靶向黑色素的PET分子影像探针，TYR已经作为一种报告基因被用于心梗移植干细胞示踪、肿瘤治疗监测等多个领域。课题组前期研究发现，TYR和黑色素靶向探针
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氟
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吡啶酰胺
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苯甲酰胺(
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F
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FPABZA)可作为报告基因体系在神经系统应用。
[0005]基于上述背景，向在体改进是神经环路病毒示踪技术的重要方向，而PET分子影像的脑区连接评估技术也需要更具特异性。因此，我们通过结合TYR PET报告基因和神经环路示踪病毒，开发了一种可用于活体可视化神经环路的PET分子影像报道基因体系。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种可用于活体的可视化神经环路的方法及工具病毒载体。
[0007]本专利技术通过以下技术方案用于实现神经环路的活体可视化成像目的：构建过表达TYR报道基因的神经环路示踪病毒载体；在局部脑区注射构建的病毒载体使得其携带的TYR
报道基因表达在注射脑区的相连区域；TYR报道基因在细胞中催化酪氨酸经多步反应成为黑色素；通过PET分子影像检测黑色素，活体可视化神经环路，可评估脑内表达TYR报告基因的脑区。
[0008]作为一个实施方案，所述神经环路示踪病毒载体包括腺相关病毒、犬腺病毒、塞母利基森林病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、狂犬病毒中的一种。
[0009]作为一个实施方案，所述TYR报道基因在细胞中的表达通过组成型启动子驱动，包括CMV启动子、EF1a启动子、EFS启动子、CAG启动子、Cbh启动子、SFFV启动子；SV40启动子、Ubc启动子、Ubi启动子、hPGK启动子、β
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actin启动子；hSyn启动子；mecp2启动子；CaMKIIα启动子；hVGAT启动子；TH启动子；gfaABC1D启动子；CD68启动子；CNP启动子。
[0010]作为一个实施方案，所述TYR的基因序列如序列1所示。
[0011]作为一个实施方案，所述TYR的氨基酸序列如序列2所示。
[0012]作为一个实施方案，所述通过PET分子影像检测黑色素，采用同时具有穿透血脑屏障及黑色素检测功能的PET探针实现。
[0013]作为一个实施方案，所述PET探针可以为
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F
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FPABZA。PET分子影像探针
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FPABZA具备良好的血脑屏障穿透能力，无需额外进行血脑屏障开放操作。
[0014]本专利技术提供的过表达TYR报道基因的神经环路示踪病毒载体可用于活体可视化全脑的神经环路连接。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0016]1、本专利技术提供的方法中，可根据逆向示踪或顺向示踪需要选择不同的神经环路示踪病毒载体，如通过retro型腺相关病毒逆向将TYR表达至注射区域的上游脑区，通过水泡性口炎病毒将TYR表达至注射区域的下游脑区。
[0017]2、本专利技术利用工具病毒载体递送TYR报道基因，在神经系统中可通过启动子选择进一步控制最终表达报道基因的神经细胞，如使用CaMKIIα启动子将表达TYR的神经元局限于兴奋性神经元，使用hVGAT启动子将表达TYR的神经元局限于抑制性神经元。
[0018]3、本专利技术提供的TYR报道基因可用于广泛神经系统区域，相比许多现有报告基因应用范围更广(如大脑纹状体等区域存在内源多巴胺D2受体表达，多巴胺D2受体报告基因应用常需要避开内源表达区域)。
附图说明
[0019]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显
[0020]图1为本专利技术中一种具体的工具病毒载体的设计示例
[0021]图2为大鼠躯体感觉皮层注射携带TYR报告基因的retro型腺相关病毒后，大鼠的
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FPABZA PET扫描图像
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本专利技术的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由权利要求及其等同物
限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0023]根据本专利技术的一种实施方案，是构建携带TYR的retro型腺相关病毒，于大鼠右侧躯体感觉皮层注射后使与注射脑区的相连区域过表达TYR报告基因，在TYR催化合成黑色素后通过
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FPABZA PET进行成像。具体操作示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于活体的可视化神经环路的方法，其特征在于，所述方法包括：构建过表达酪氨酸酶(TYR)报道基因的神经环路示踪病毒载体；局部脑区注射神经环路示踪病毒载体驱动全脑相连区域的TYR报道基因表达；TYR报道基因在细胞中催化酪氨酸经多步反应成为黑色素；通过PET分子影像检测黑色素，活体可视化神经环路。2.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化神经环路的方法，其特征在于，所述神经环路示踪病毒载体为腺相关病毒、犬腺病毒、塞母利基森林病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、狂犬病毒中的一种。3.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化神经环路的方法，其特征在于，所述神经环路示踪病毒载体携带组成型启动子。4.根据权利要求3所述的一种可用于活体的可视化神经环路的方法，其特征在于，所述组成型启动子选自CMV启动子、EF1a启动子、EFS启动子、CAG启动子、Cbh启动子、SFFV启动子；SV40启动子、Ubc启动子、Ubi启动子、hPGK启动子、β
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actin启动子；hSyn启动子；mecp2启动子；CaMKIIα启动子；hVGAT启动子；TH启动子；gfaABC1D启动子；CD68启动子；CNP启动子。5.根据权利要求1所述的一种可用于活体的可视化神经环路的方法，其特征在于，所述神经环路示踪病毒载体表达TYR报道蛋白的基因序列包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：田梅，张宏，金晨涛，钟燕，周瑞，张晓辉，王菁，罗晓芸，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：