一种布鲁氏菌制造技术

本发明专利技术公开了一种布鲁氏菌

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量RT
‑
PCR检测引物及应用


[0001]本专利技术涉及细菌检测
，具体涉及一种布鲁氏菌
TaqMan
实时荧光定量
RT
‑
PCR
检测引物及应用
。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病又称马尔他热或波状热，是由布鲁氏菌引起的以家畜为主的多种动物互为传染源的人畜共患病
。
布鲁氏菌可感染人类
、
多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热
、
流产与不育
、
慢性关节炎及神经损害等
。
因此导致了巨大的经济损失，并引起严重的公共卫生问题
。
有文献报道，全世界每年报告的人类布鲁氏菌病病例约为
50
万例，每年因该病造成的经济损失约
30
亿美元
。
[0003]布鲁氏菌的快速
、
准确的鉴定对有效控制和预防疾病至关重要
。
当下，病原学检查即细菌分离培养，依赖于细菌在实验室培养基上生长和繁殖并形成可见菌落的能力，方法可靠，成本低廉，是诊断布鲁氏菌的“金标准”。
但是以上方法均非常耗时，需要长达一周的时间来确认，而且需要专门的设备和专业知识，在疾病高度流行的地区，血清学测试也不是非常特异
。
因此，需要一种快速
、
准确的布鲁氏菌鉴定方法克服以培养为基础的检测的局限性
。
[0004]随着技术的发展，布鲁氏菌可以通过高度区分的分子技术，如多重聚合酶链式反应
、
多位点测序分型或多位点可变数目串联重复分析而清楚地相互区分
。TaqManPCR
是一种广泛应用于核酸检测和定量的方法
。
该方法是基于使用特定的引物和探针，结合到目标
DNA
序列，并在扩增过程中产生荧光信号
。
相比于荧光染料直接加入的实时荧光定量
PCR,
特异性更为优秀，且具有开发为高通量
、
多重基因检测的潜质
。TaqMan PCR
已用于检测布鲁氏菌等多种病原菌
。
本研究旨在建立一种
、
高灵敏性
、
高特异性的
TaqMan
荧光
PCR
检测方法，用于布鲁氏菌感染的早期检测及筛查，以期及时消除潜在的致病风险，保障公共卫生安全
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于为建立快速准确检测布鲁氏菌感染的荧光定量
PCR
方法，利用布鲁氏菌
IS711
基因序列设计特异性引物和探针，并对该方法的特异性和敏感性进行了评价，以解决现有检测布鲁氏菌检测技术操作繁琐
、
耗费时间久
、
灵敏度低等不足的问题
。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种布鲁氏菌特异性
TaqMan
实时荧光定量
PCR
的引物和探针
。
[0008]所述引物包括上游引物
IS711
‑
F
和下游引物
IS711
‑
R
，所述探针为
IS711
‑
Probe。
上游引物
IS711
‑
F
序列为：
5'
‑
AAAGCGATTTCATGCGTCGTG
‑
3'
；下游引物
IS711
‑
R
：
5'
‑
TTATCGAAAAGGATGGCAAGCG
‑
3'
，探针序列为：
IS711
‑
Probe
：
5'
‑
FAM
‑
TCCGCCGGGTCCAGCCAATCCA
‑
BHQ1
ꢀ‑
3'
，探针的
5'
端标记有荧光报告基团
FAM
，其
3'
端标记有淬灭基团
BHQ1。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种基于上述本专利技术的引物和探针的曼氏杆菌属细菌特异性
TaqMan
实时荧光定量
PCR
检测方法，包括以下步骤：
[0010]提取检测样品的细菌基因组
DNA
作为模板；
[0011]使用上述引物和探针进行实时荧光定量
PCR
反应；
[0012]反应结束后，根据检测样品的扩增曲线和
Ct
值判定检测样品中是否存在布鲁氏菌
。
[0013]进一步地：
[0014](1)20
μ
L
最佳反应体系：
Premix Ex Taq(2X)10
μ
L
，浓度为
10
μ
M
上下游引物各
0.5
μ
L
，浓度为
10
μ
M
探针的
0.5
μ
L
，模板2μ
L
，用无菌水补足体系为
20
μ
L。
[0015](2)
最佳反应条件：
95℃5sec、55℃5sec(10cycles)
，
95℃2min(1cycle)
，
95℃5sec、50℃30sec(40cycles)
；
[0016]标准曲线方程为：
Y
＝－
3.6945logX+35.997
，
R2＝
0.999
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0017]公式
(1)
中：
Y
为扩增的检测样品的
Ct
值，
X
为检测样品
DNA
的起始拷贝数
。
[0018]将检测样品的
Ct
值代入方程
(1)
中即可以计算出检测样品中布鲁氏菌
DNA
的起始拷贝数，再根据提取
DNA
所用的检测样品的质量，推算出检测样品中布鲁氏菌的绝对含量，从而实现对检测样品中布鲁氏菌的绝对定量检测
。
[0019](3)
定性检测结果判定标准为：检测样品的荧光定量
PCR
反应出现扩增曲线为阳性，表示检测样品中存在布鲁氏菌
DNA
；检测样品的...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种布鲁氏菌
TaqMan
实时荧光定量
RT
‑
PCR
检测引物和探针，其特征在于：所述引物为：
F
：
5'
‑
AAAGCGATTTCATGCGTCGTG
‑
3'
和
R
：
5'
‑
TTATCGAAAAGGATGGCAAGCG
‑
3'
，所述的探针为
P
：
5'
‑
FAM
‑
TCCGCCGGGTCCAGCCAATCCA
‑
BHQ1
‑
3'。2.
一种布鲁氏菌特异性
TaqMan
实时荧光定量
PCR
检测方法，其特征在于：所述
TaqMan
实时荧光定量
PCR
检测所用的引物和探针为如权利要求1所述的引物和探针；该检测方法包括以下步骤：步骤一
、
提取检测样品的细菌基因组
DNA
作为模板；步骤二
、
使用所述引物和探针进行实时荧光定量
PCR
反应；步骤三
、
反应结束后，根据检测样品的扩增曲线和
Ct
值判定检测样品中是否存在布鲁氏菌
。3.
根据权利要求2所述的一种布鲁氏菌特异性
TaqMan
实时荧光定量
PCR
检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量
PCR
反应包括：
PCR
反应体系为：
Premix Ex Taq(2X)10
μ
L
，浓度为
10
μ
M
上下游引物各
0.5
μ
L
...

【专利技术属性】
技术研发人员：常秀琴，郝梦，雷振华，
申请(专利权)人：常秀琴，
类型：发明
国别省市：