一种核酸提取管、微流控芯片和多重核酸一体化检测的方法技术

本发明专利技术提供了一种核酸提取管、微流控芯片和多重核酸一体化检测的方法。该核酸提取管包括管体、推杆、连接在推杆底部的活塞、隔塞组件和连接在管体底部的连接头；管体通过连接头与微流控芯片密封相通连接；隔塞组件的设置使得结合核酸的磁珠在外部磁场的作用下依次通过核酸裂解液、矿物油层，并进入反应液中，最后进入包括流体控制区、等温扩增区、CRISPR/Cas12a反应区和无出气孔的气体缓冲区的微流控芯片中进行CRISPR/Cas12a

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取管、微流控芯片和多重核酸一体化检测的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种核酸提取管、微流控芯片和多重核酸一体化检测的方法。

技术介绍

[0002]感染性疾病是人类健康的严重威胁，而呼吸道感染更是临床最主要的感染类型。据统计，90％以上呼吸道感染是由病毒引起的，引起的感染多具有传染性强、流行面广、死亡率高等特点，如引起严重急性呼吸道综合征的SARS病毒，禽流感病毒以及新型冠状病毒等。随着全球一体化的形成，病毒传播更加迅速，及时有效的病原学诊断和有效的感染防控成为国家医疗卫生发展的重大需求。目前核酸检测是诊断呼吸道病毒感染的金标准，但现有经典核酸检测方法如常规PCR技术，对检测场地、设备和人员要求苛刻，严重限制了病毒感染在门急诊、床旁及社区的应用。因此，提升感染性疾病早诊快诊能力建设，加快不受检测场地限制的核酸检测产品的研发成为国家医疗卫生发展的重大需求。分子诊断为基础的分子即时检验解决方案应运而生。这类产品将样品处理、核酸提取以及基因扩增所需要的各类试剂预先封装在盒内，使用者只需将加入样品的测试盒放入仪器相应位置，仪器全自动完成后续的检测及结果显示工作。较之传统的分子检测方法及硬件要求，这种一体化分子POCT平台实现了“样品进
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结果出”的全新核酸检测。国外商品化分子POCT产品由于价格昂贵，不能做到紧贴中国诊断市场需求，很难在我国临床实现常规应用。国内应用于临床的分子POCT产品只能实现对单一病原体的即时检测，尚无法实现对呼吸道病毒多重、混合感染的诊断和鉴别诊断。
[0003]目前市场上常见的分子POCT企业，多采用PCR和恒温扩增的方法，PCR是一个几何级数扩增的过程，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，从而增加仪器的成本。恒温核酸扩增克服了传统PCR反应需通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的扩增效率。但等温扩增技术引起非特异性扩增的概率相对较高，使得其实际应用范围变窄，未能真正显示出其检测优势。CRISPR技术凭借Cas蛋白/sgRNA复合物精准识别和剪切目标基因，同时会非特异性的、持续的切割荧光基团和淬灭基团的报告分子，并释放大量荧光信号，达到检测的目的。持续的反式剪切带来的高灵敏度，精准识别的高特异性，大幅降低了恒温扩增的假阳性风险，且不依赖复杂或大型的设备。本专利技术拟提供基于CRISPR技术的一体化微流控芯片检测设备。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种核酸提取管、微流控芯片和多重核酸一体化检测的方法，可应用于医院门急诊、社区和基层医疗机构病原体的快速筛查。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术的第一方面是提供一种核酸提取管，其包括管体、推杆、连接在推杆底部的
活塞、隔塞组件和连接在管体底部的连接头；管体通过连接头与微流控芯片密封相通连接；
[0007]隔塞组件包括第一隔塞、第二隔塞和第三隔塞；该第一隔塞和第二隔塞均包括一底板，底板的截面由一优弧和直线组成，该优弧的半径和管体的内径相同；第三隔塞为一带有凹槽的圆柱，其半径和管体的内径相同，凹槽对应的底部设置一孔隙使得凹槽与管体的底部相通；
[0008]装配核酸提取管时，第三隔塞、第二隔塞和第一隔塞由上至下依次放置在管腔内；第二隔塞的底板放置在第三隔塞的凹槽竖直开口面上，第三隔塞放置在管体底部上，第一隔塞的底板以上的管体壁上设置一气孔。
[0009]进一步地，优弧的角度为250～350
°
，优选为270～330
°
。
[0010]进一步地，第二隔塞与第一隔塞形成的空腔放置矿物油，凹槽与第二隔塞之间的空腔放置RPA反应液，第一隔塞的底板以上的管腔内放置有含有磁珠的核酸裂解液，气孔与核酸裂解液的液面平齐或在液面以上。
[0011]进一步地，装配完成后，第一隔塞和第二隔塞底板直线所对应的竖直平面在同一平面内，与凹槽的水平开口方向垂直；优选地，上述孔隙设置在与竖直平面相对的第三隔塞的底部边缘。
[0012]进一步地，孔隙为一竖直截面为长方形的槽。
[0013]进一步地，第一隔塞还包括由其底板向上延伸的两个曲面立体结构使得第一隔塞具有一水平通道；水平通道的一竖直截面以第一隔塞的底板截面直线为底边。
[0014]进一步地，第二隔塞为一上端开口的筒状体，筒状体沿着第二隔塞底板直线所相应的竖直平面设置一矩形缺口。
[0015]进一步地，隔塞组件是由聚四氟乙烯经机加工而成。
[0016]本专利技术的第二方面是提供一种微流控芯片，与上述核酸提取管密封连接用于病原体核酸检测，该微流控芯片包括中心孔和汇集在中心孔的若干个通道；若干个通道均包括依次连接的逶迤通道、用于等温扩增的反应微室、连接通道、Crispr反应池和气体缓冲区；
[0017]通过连接头，核酸提取管与中心孔密封连通。
[0018]进一步地，上述汇集在中心孔的通道的数目为偶数个，优选为4个，6个，8个......
[0019]进一步地，反应微室包被有待测基因的RPA引物；Crispr反应池内置相应待测基因扩增产物的干粉化Cas12a蛋白和相应靶基因的crRNA。
[0020]进一步地，上述微流控芯片是采用雕刻机雕刻PMMA板获得，上下表面均采用专用透明微流控胶带密封。
[0021]本专利技术的第三方面是提供一种多重核酸一体化检测的方法，其采用上述核酸提取管和微流控芯片进行检测；方法包括如下步骤：
[0022]步骤一，组装核酸提取管：将第三隔塞放置在管体底部上，加入RPA反应液；将第二隔塞放置在第三隔塞的凹槽竖直开口面上，加入一定量的矿物油；将第一隔塞放置在矿物油表面，加入含有待测样本和磁珠的核酸裂解液；将底部连接活塞的推杆推入管腔内；第一隔塞和第二隔塞与管体内表面之间的缝隙在竖直面上平行；
[0023]步骤二，组装微流控芯片：将待测基因的RPA引物包被在反应微室内，将待测基因扩增产物的干粉化Cas12a蛋白和相应靶基因的crRNA放入Crispr反应池内；通过连接头将核酸提取管与中心孔密封连通；
[0024]步骤三，待裂解完成后，结合有基因组DNA的磁珠在外部磁场的作用下穿过矿物油与RPA反应液混合；
[0025]步骤四，向下推动推杆，使得RPA反应液进入反应微室内；扩增反应完成后，继续向下推动推杆，将扩增产物全部转移至Crispr反应池中，读取结果。
[0026]进一步地，扩增反应的条件为：30～40℃，10～20min；扩增产物在Crispr反应池(9
‑
4)中的反应条件为30～40℃，10～20min。
[0027]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0028]本专利技术提供的装置和方法可用于简单、快速、床旁检测病原体核酸，具有操作简单、快速、无需特殊仪器的特点，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取管，其特征在于，包括管体、推杆(1)、连接在所述推杆(1)底部的活塞(2)、隔塞组件和连接在管体底部的连接头(8)；所述管体通过所述连接头(8)与微流控芯片密封相通连接；所述隔塞组件包括第一隔塞(5)、第二隔塞(6)和第三隔塞(7)；所述第一隔塞(5)和第二隔塞(6)均包括一底板，所述底板的截面由一优弧和直线组成，所述优弧的半径和所述管体的内径相同；所述第三隔塞(7)为一带有凹槽的圆柱，其半径和所述管体的内径相同，所述凹槽对应的底部设置一孔隙使得所述凹槽与所述管体的底部相通；装配所述核酸提取管时，所述第三隔塞(7)、第二隔塞(6)和第一隔塞(5)由上至下依次放置在管腔(4)内；所述第二隔塞(6)的底板放置在第三隔塞(7)的凹槽竖直开口面上，所述第三隔塞(7)放置在所述管体底部上，所述第一隔塞(5)的底板以上的管体壁上设置一气孔(3)。2.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，所述优弧的角度为250～350
°
，优选为270～330
°
。3.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，所述第二隔塞(6)与所述第一隔塞(5)形成的空腔放置矿物油，所述凹槽与所述第二隔塞(6)之间的空腔放置RPA反应液，所述第一隔塞(5)的底板以上的管腔(4)内放置有含有磁珠的核酸裂解液，所述气孔(3)与所述核酸裂解液的液面平齐或在液面以上。4.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，装配完成后，所述第一隔塞(5)和第二隔塞(6)底板直线所对应的竖直平面在同一平面内，与所述凹槽的水平开口方向垂直；优选地，所述孔隙设置在与所述竖直平面相对的所述第三隔塞(7)的底部边缘。5.根据权利要求4所述的核酸提取管，其特征在于，所述孔隙为一竖直截面为长方形的槽。6.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，所述第一隔塞(5)还包括由其底板向上延伸的两个曲面立体结构使得所述第一隔塞(5)具有一水平通道；所述水平通道的一竖直截面以所述第一隔塞(5)的底板截面直线为底边。7.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，所述第二隔塞(6)为一上端开口的筒状体，所述筒状体沿着所述第二隔塞(6)底板直线所相应的竖直平面设置一矩形缺口。8.根据权利要求1所述的核酸提取管，其特征在于，所述隔塞组件是由聚四氟乙烯经机加工而成。9.一种微流控芯片，与如权利要求1
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8所述的核酸提取管密封连接用于病原体核酸检测，其特征在于，所述微流控芯片(9)包括中心孔(a)和汇集在所述中心孔(a)的若干个通道；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪骅，李敏，徐靖嵩，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：