生产1,3-丙二醇的重组密歇根克雷伯氏菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种经遗传改造的重组密歇根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)，其具有活性降低的或失活的葡萄糖特异性PTS转运系统、甘油激酶、甘油脱氢酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、富马酸还原酶和3

【技术实现步骤摘要】
生产1,3
‑
丙二醇的重组密歇根克雷伯氏菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种新型的用于生产
1,3
‑
丙二醇的重组密歇根克雷伯氏菌
(Klebsiella michiganensis)
及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]1,3
‑
丙二醇是一种重要的二元醇，可以与二元羧酸缩聚合成聚酯类高分子材料，还可用于生产增塑剂
、
表面活性剂
、
乳化剂
、
破乳剂
、
润滑油
、
染料
、
油墨
、
防冻剂
、
化妆品等
。
[0003]丙烯醛法和环氧乙烷法是目前
1,3
‑
丙二醇主要采用的化学合成方法
。
这两种技术成熟可靠，但生产成本较高，会产生污染环境的废物，限制了大规模应用
。
[0004]生物合成方法相对于化学合成方法更为环保，且自然界中拥有多种天然高产
1,3
‑
丙二醇的菌株
。
例如，肺炎克雷伯氏菌
(Klebsiella pneumoniae)、
产酸克雷伯氏菌
(Klebsiella oxytoca)、
弗氏柠檬酸菌
(Citrobacter freundii)
等等
。
这些菌株通过在厌氧或微厌氧条件下代谢甘油合成
1,3
‑
丙二醇并同时获取生长所需的物质与能量
。
但甘油转化为
1,3
‑
丙二醇的转化率实际只有
60
‑
70
％，且甘油价格较高，导致发酵成本过高
。
为进一步降低
1,3
‑
丙二醇的生产成本，以葡萄糖为原料发酵合成
1,3
‑
丙二醇成为研究目标
。
[0005]杜邦公司开发了以葡萄糖为原料一步发酵合成
1,3
‑
丙二醇的大肠杆菌工程菌
(CN 100471946C)
，大大降低了
1,3
‑
丙二醇的生产成本，
1,3
‑
丙二醇产量可达
135g/L
，质量转化率可达
51
％，但该技术存在较多缺陷
。
例如，大肠杆菌缺乏
1,3
‑
丙二醇合成的关键蛋白，使用质粒表达相关蛋白不仅需要在培养过程中添加多种抗生素，并且存在质粒丢失导致的表达缺陷，从而造成发酵效果不稳定；大肠杆菌本身不存在关键辅酶
B12
的合成与修复能力，因此维生素
B12
的添加量较大，但维生素
B12
的价格极为昂贵
。
[0006]为减少维生素
B12
的用量以降低成本，
Suman Lama
等将天然高产
1,3
‑
丙二醇的肺炎克雷伯氏菌
J2B
改造为了一株能以葡萄糖为碳源合成
1,3
‑
丙二醇的工程菌株
(https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.09.001)。
由于肺炎克雷伯氏菌
J2B
拥有完善的维生素
B12
合成系统和修复系统，因此发酵过程中只需添加
5.4mg/L
的维生素
B12
，该添加量为杜邦公司技术所需量的十分之一，但该技术在其它方面存在缺陷
。
在发酵指标上，质量转化率达到了
53.6
％，但
1,3
‑
丙二醇产量仅
62g/L
，远低于杜邦的技术指标；甘油合成
、
脱水
、3
‑
羟基丙醛还原等过程中的关键模块蛋白的表达仍以质粒为载体，依然存在抗生素添加及质粒丢失等问题
。
[0007]目前已有的
1,3
‑
丙二醇发酵合成技术均未能在维生素
B12
的用量
、
质量转化率
、1,3
‑
丙二醇产量等三个关键指标实现全面改进，均需要使用质粒表达关键蛋白，因此在发酵过程中需要添加抗生素，并且存在发酵不稳定等问题
。
因此，
1,3
‑
丙二醇的生物合成技术还需要进一步的改进
。

技术实现思路

[0008]为优化
1,3
‑
丙二醇的生物合成技术，本专利技术人首先从土壤中分离筛选出一株密歇根克雷伯氏菌，该菌株拥有维生素
B12
的合成及修复系统
。
在代谢工程改造的过程中全部使用基因组整合调控的方式对该菌株进行改造，不使用质粒，避免了抗生素的使用并极大提高了发酵效果的稳定性
。
在以葡萄糖为原料
、
不添加维生素
B12
的条件下，经改造的菌株
YY
‑
P023(
于
2022
年3月
23
日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
(CGMCC
，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
)
，保藏号为
CGMCC No.24576)
的
1,3
‑
丙二醇产量可达
92g/L
，质量转化率达
54
％
。
使用经改造的菌株
YY
‑
P023
的发酵技术在
1,3
‑
丙二醇产量
、
质量转化率
、
维生素
B12
用量以及抗生素使用等四方面取得了巨大的综合优势，显著降低了
1,3
‑
丙二醇生物合成的综合成本
。
[0009]在一个方面，本专利技术提供了一种经遗传改造的重组密歇根克雷伯氏菌，其具有活性降低的或失活的葡萄糖特异性
PTS
转运系统
、
甘油激酶
、
甘油脱氢酶
、
醇脱氢酶
、
乙酰乳酸合酶
、
乙酰乳酸脱羧酶
、3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶和富马酸还原酶，具有
、
优选增强的
NADPH
依赖型醇脱氢酶
、
二醇脱水酶
、3
‑
磷酸甘油脱氢酶和3‑
磷酸甘油本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种经遗传改造的重组密歇根克雷伯氏菌
(Klebsiella michiganensis)
，其具有活性降低的或失活的葡萄糖特异性
PTS
转运系统例如
IIBC
组分
、
甘油激酶
、
甘油脱氢酶
、
醇脱氢酶
、
乙酰乳酸合酶
、
乙酰乳酸脱羧酶
、
富马酸还原酶和3‑
磷酸甘油醛脱氢酶，具有
、
优选增强的
NADPH
依赖型醇脱氢酶
、
二醇脱水酶
、3
‑
磷酸甘油脱氢酶和3‑
磷酸甘油磷酸酶活性，任选地，还具有活性降低的或失活的磷酸葡萄糖酸脱水酶和
/
或丙酮醛合酶，和
/
或具有
、
优选增强的果聚糖蔗糖转移酶活性和
/
或氯霉素乙酰转移酶活性
。2.
权利要求1的重组密歇根克雷伯氏菌，其
(1)
具有弱化或失活优选缺失的
ptsG、glpK、gldA1、gldA2、adhE、budB、budA
基因和
frdABCD
基因簇：
(2)
具有表达的
、
优选过表达的
yqhd
基因，优选来自大肠杆菌的
yqhd
基因，
(3)
具有表达的
、
优选过表达的
pdu
基因簇
、GPD1
和
GPP2
基因；
(4)
具有弱化的
GapA
基因，以及任选地，所述重组密歇根克雷伯氏菌还具有弱化或失活优选缺失的
edd
和
/
或
mgsA
基因，和
/
或表达的
、
优选过表达的
sacB
基因和
/
或
cat
基因
。3.
权利要求2的重组密歇根克雷伯氏菌，其中
(1)
所述
ptsG
基因包含
SEQ ID NO
：
102
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(2)
所述
glpK
基因包含
SEQ ID NO
：
103
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(3)
所述
gldA1
基因包含
SEQ ID NO
：
104
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(4)
所述
gldA2
基因包含
SEQ ID NO
：
105
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(5)
所述
adhE
基因具有
SEQ ID NO
：
106
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(6)
所述
budB
基因包含
SEQ ID NO
：
107
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(7)
所述
budA
基因包含
SEQ ID NO
：
108
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(8)
所述
yqhd
基因包含
SEQ ID NO
：
100
具有所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(9)
所述
pdu
基因簇包含
SEQ ID NO
：
109
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(10)
所述
GPD1
基因包含
SEQ ID NO
：
110
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(11)
所述
GPP2
基因包含
SEQ ID NO
：
111
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(12)
所述
GapA
基因包含
SEQ ID NO
：
112
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(13)
所述
frdABCD
基因簇包含
SEQ ID NO
：
113
所示的核苷酸或其简并序列序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(14)
所述
edd
基因包含
SEQ ID NO
：
114
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(15)
所述
mgsA
基因包含
SEQ ID NO
：
115
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列；和
/
或
(16)
所述
sacB
基因包含
SEQ ID NO
：
116
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列
。(17)
所述
cat
基因包含
SEQ ID NO
：
117
所示的核苷酸序列或其简并序列或与其具有至少
75
％相同性的核苷酸序列
。4.
权利要求2或3的重组密歇根克雷伯氏菌，其中：
(1)
所述
pdu
基因簇
、GPD1、GPP2
和
/
或
yqhd
基因处于强启动子控制下，例如
Pdu
‑
31、GP
‑
28、Yqhd
‑2启动子，和
/
或
(2)
所述
GapA
基因处于弱启动子控制下，例如
GapA
‑
42
启动子，和
/
或
(3)
所述
yqhd
基因位于
edd
基因位点，和
/
或
(4)
所述
GPD1
和
GPP2
位于
mgsA
基因位点
。5.
权利要求1‑4任一项的重组密歇根克雷伯氏菌，其为保藏在
CGMCC
的保藏号为
CGMCC No.24576
的菌株
。6.
一种制备生产
1,3
‑
丙二醇的重组密歇根克雷伯氏菌的方法，包括：在初始密歇根克雷伯氏菌菌株中降低或失活葡萄糖特异性
PTS
转运系统例如组分
IIBC、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，于勇，徐洪涛，
申请(专利权)人：天津智合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：