一种重组生物防御融合蛋白及其应用制造技术

本披露提供一种重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在特定位置含有特定的氨基酸突变。所述重组蛋白具有较高的抗菌和抗病毒活性，具有良好的应用前景。本披露还提供了含编码所述蛋白的核酸序列的载体、宿主细胞，以及含所述重组蛋白或载体的医疗器械或药物。所述医疗器械包括：创伤敷料、抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒(HPV)敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。阴道栓。

【技术实现步骤摘要】
一种重组生物防御融合蛋白及其应用


[0001]本披露涉及生物化工
，具体涉及一种重组蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]乳铁蛋白(lactoferrin)是一种存在于乳制品和人体分泌物中的蛋白质。乳铁蛋白作为天然生物防御因子或生物防御素，具有多种生物学活性，包括抗菌和抗病毒作用。
[0003]乳铁蛋白通过多种机制发挥其抗菌和抗病毒的作用。包括络合铁离子、与细菌细胞膜上的脂蛋白相互作用、以及与细菌和病毒的DNA结合等；从而阻止细菌和病毒的繁殖和生存。
[0004]但是，乳铁蛋白的天然产量很低，同时仍期望乳铁蛋白的抗菌和抗病毒活性能有所提高。目前对于通过改造乳铁蛋白并人工生物合成，获得更高活性和更高产量存在迫切的需求。

技术实现思路

[0005]已知乳铁蛋白(lactoferrin)是一种广泛存在于乳制品和人体分泌物中的蛋白质。乳铁蛋白具有多种生物学活性，包括抗菌和抗病毒作用，其通过多种机制发挥其活性。
[0006]专利技术人对牛乳铁蛋白(SEQ ID NO:1)的截短体(N
‑
端叶第1
‑
332aa)做肽段突变分析，筛选了多个突变位点，其中包括三个结构稳定性潜在较优的突变体，分别是Q199R、L161P、P147R，其中Q199和P147位点处于DNA结合功能区；Q199R和P147R突变导致分子柔性下降，L161P突变导致分子柔性提高。
[0007]实验测试发现，P147R和L161P突变体的抗菌、抗病毒活性优于Q199R突变体。不受理论束缚地，专利技术人推测P147位残基突变成精氨酸后，有可能增强了与细菌或病毒的蛋白和核酸的结合，进而增强了对细菌和病毒的抑制作用。
[0008]专利技术人随后同时引入P147R和L161P突变，然后与促穿膜域、促愈合域、促折叠域融合，得到重组乳铁蛋白(SEQ ID NO:2)。融合促穿膜域的目的在于提高蛋白在细胞膜上的锚定与穿透功能，可能有潜力促进乳铁蛋白生物防御功能肽段破坏细菌或者病毒的包膜，一方面物理穿孔，破坏细菌病毒膜结构，一方面乳铁蛋白肽段与膜内的细菌或病毒核酸或蛋白通过电荷吸附物理结合，诱导核酸或蛋白的空间变构，阻断其正常生物学功能，从而抑制细菌或病毒的增殖。另外尝试通过促折叠域提高蛋白正确折叠与可溶性，增强蛋白产量和溶解度。而实验测试表明，双点突变体重组蛋白(SEQ ID NO:10)具有较强的抗菌和抗病毒活性，重组乳铁蛋白的抗菌、抗病毒活性相比牛乳铁蛋白截短体的单点突变体和双点突变体都进一步增强，且强于牛乳铁素。
[0009]因此，在本披露的第一方面，提供一种重组蛋白，其特征在于，
[0010]a.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第157位为残基R，在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第171位为残基P；
[0011]或者
[0012]b.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第327位为残基R，在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第341位为残基P。
[0013]在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2。
[0014]在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
[0015]在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0016]在本披露的第二方面，提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如第一方面所述的蛋白。
[0017]在一些实施方案中，所述编码序列经过了密码子优化。
[0018]在一些实施方案中，所述密码子优化用于在真核或原核细胞中表达。
[0019]在一些实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
[0020]在一些实施方案中，所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母或动物细胞。
[0021]在本披露的第三方面，提供一种载体，其特征在于，所述载体包含编码如第一方面所述的蛋白的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列可操作地连接的调控序列。
[0022]在一些实施方案中，所述调控序列为启动子和/或增强子序列，所述调控序列用于调控所述编码序列的表达。
[0023]在一些实施方案中，所述载体为质粒。
[0024]在本披露的第四方面，提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如第三方面所述的载体。
[0025]所述宿主细胞是指已引入所述载体的细胞，包括此类细胞的后代。
[0026]在一些实施方案中，所述载体为质粒。
[0027]在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0028]在一些实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
[0029]在一些实施方案中，所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母或动物细胞。
[0030]在本披露的第五方面，提供一种制备如第一方面所述蛋白的方法，其包含下述步骤：将如第四方面中任一项所述的宿主细胞的载体进行表达，然后进行分离纯化得到。
[0031]在一些实施方案中，所述表达为组成表达和/或诱导表达。
[0032]在本披露的第六方面，提供一种医疗器械，其特征在于，所述医疗器械包含如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细胞。
[0033]在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：创伤敷料、抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
[0034]在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：抑菌敷料、抗病毒敷料。
[0035]在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：抑菌敷料、抗人乳头瘤病毒敷料。
[0036]在一些实施方案中，所述医疗器械任选自：创伤敷料、阴道敷料、宫颈敷料、阴茎润滑组合物、消毒液、洗液、口腔护理膏、阴道栓。
[0037]在本披露的第七方面，提供一种药物，其特征在于，所述药物包含如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细
胞。
[0038]在一些实施方案中，所述药物为抗细菌药或抗病毒药。
[0039]在一些实施方案中，所述药物包含药学上可接受的辅料。
[0040]在本披露的第八方面，提供如第一方面所述的蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的载体或如第四方面所述的宿主细胞在制备药物或医疗器械中的应用。
[0041]在一些实施方案中，所述药物为用于治疗细菌和/或病毒感染的药物。进一步地，在一些实施方案中，所述药物为用于治疗HPV病毒感染的药物。在一些实施方案中，所述药物为用于治疗细菌感染的药物。
[0042]在一些实施方案中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，a.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第157位为残基R，在对应于SEQ ID NO:10所示序列的第171位为残基P；或者b.所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示序列具有≥99％的序列同一性，并且在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第327位为残基R，在对应于SEQ ID NO:2所示序列的第341位为残基P。2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:2。3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的蛋白。4.一种载体，其特征在于，所述载体包含编码权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列可操作地连接的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，易祥，
申请(专利权)人：广西福莱明生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：