一种融合因子配方组合工艺组成比例

本发明专利技术公开了一种融合因子配方组合工艺，包括以下步骤：1)酵母菌扩培发酵；2)菌体收集破碎分离纯化；3)凝胶分离纯化；4)复配组合物，其中，在菌体收集破碎分离纯化步骤中，利用GST亲和层析法，对已用滤膜过滤的菌体破碎上清进行纯化，pH8.0缓冲液并收集洗脱液，收集到的GST纯化样品经超滤管浓缩后，置换其中的GSH；D、再用0.22μm滤膜过滤后按照上述方法上样至阴离子交换柱，按照Q柱纯化方法进行融合蛋白的第二步纯化，收集Q离子柱洗脱液。通过添加GST促溶标签，明显提高目的蛋白的可溶性表达，目的蛋白表达量占总蛋白的21.58％，可达0.13mg/mL，通过GST亲和层析与阴离子交换层析两步纯化后目的蛋白的纯度达到92.57％。两步纯化后目的蛋白的纯度达到92.57％。

【技术实现步骤摘要】
一种融合因子配方组合工艺


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为一种融合因子配方组合工艺。

技术介绍

[0002]融合因子抗HPV感染的主要作用机制通过融合因子表面构象中的正电荷部分与病毒颗粒的负电荷部分相互缠结，使HPV病毒表面所带负电荷与融合因子中间疏水区肽酶识别位点的正电荷相结合，将膜转位信号与核定位信号偶联，以正负电荷相亲和的物理吸附原理，结合病毒的蛋白核酸的功能部位，干扰病毒识别，结合，复制，组装和释放，阻断HPV感染细胞的整个通路。
[0003]融合因子还能通过竞争结合细胞膜病毒受体结合部位，阻滞病毒吸附进入宿主细胞；融合因子能激活宿主免疫应答信号通路，调节提高免疫细胞对病毒的防御；融合因子的穿膜功能肽段，可以携带抗病毒功能肽段和促修复功能肽段，靶向输送至胞内结构区域，促进融合因子与不同区域的病毒蛋白核酸结合，从而在不同环节干扰病毒增殖周期的各个过程，减少HPV病毒载量，抑制病毒基因表达，预防癌前病变或恶性转化；而且这种靶向穿膜作用，不会造成细胞损伤，从而确保融合因子高效安全的阻断病毒感染通路，激活局部免疫应答。
[0004]HPV病毒只寄居在皮肤和黏膜上皮细胞，不进入血液，因此，局部外用融合因子阴道阻菌凝胶更容易达到感染部位，可在皮肤或粘膜(如生殖道内壁)形成一层保护膜，物理阻隔病毒与细胞表面接触，抑制病毒吸附，钝化病毒侵染能力，同时激活免疫防御，起到预防HPV感染诱发的各种病变作用。
[0005]尽管目前已有一些PHPV蛋白的基因工程生产方法，但这些方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，基于此，本申请提出一种融合因子配方组合工艺以解决上述问题。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种融合因子配方组合工艺，具备工艺提取技术更简单、操作成本更低以及蛋白纯度更高的优点，解决了目前已有的一些PHPV蛋白的基因工程生产方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低的问题。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种融合因子配方组合工艺，包括以下步骤：
[0010]1)酵母菌扩培发酵；
[0011]2)菌体收集破碎分离纯化；
[0012]3)凝胶分离纯化；
[0013]4)复配组合物。
[0014]优选的，所述酵母菌扩培发酵包括以下步骤：
[0015]A、从
‑
70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中35
‑
38℃，210
‑
230r/min，培养12
‑
16h；
[0016]B、将菌液按照1:100转接至100mL的LB液体培养基中，35
‑
38℃，210
‑
230r/min，继续培养到OD600为0.6
‑
0.8时；
[0017]C、加入1mol/L的异丙基β
‑
D
‑1‑
硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，12
‑
20℃，210
‑
230r/min条件下继续诱导培养10
‑
14h，含穿膜肽的融合蛋白表达于菌种中。
[0018]优选的，所述LB液体培养基中含100μg/mL氨苄青霉素。
[0019]优选的，所述菌体收集破碎分离纯化包括以下步骤：
[0020]A、将发酵液采用6000
‑
7200r/min室温离心8
‑
12min，收集菌体，用蒸馏水将菌体洗涤两次后加入破碎缓冲液重悬菌体；
[0021]B、在冰浴件下超声破碎18
‑
22min，对破碎后的全菌液采用9600
‑
10000r/min，3
‑
5℃，25
‑
35min冷冻离心，分离上清和沉淀；
[0022]C、利用GST亲和层析法，对已用0.45μm滤膜过滤的菌体破碎上清进行纯化，pH8.0缓冲液并收集洗脱液，收集到的GST纯化样品经超滤管浓缩后，置换其中的GSH；
[0023]D、再用0.22μm滤膜过滤后按照上述方法上样至阴离子交换柱(QFocurose 6HP 5mL)，按照Q柱纯化方法进行融合蛋白的第二步纯化，收集Q离子柱洗脱液。
[0024]优选的，所述破碎条件为：6mm变幅杆，频率30％，超声3s，间隔3s，所述pH8.0缓冲液为10mmol/L GSH和50mmol/L Tris
‑
HCl的混合溶液。
[0025]优选的，所述凝胶分离纯化包括以下步骤：
[0026]用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，将收集液于
‑
20℃冷冻保存。
[0027]优选的，所述复配组合物包括以下步骤：
[0028]将冷冻原液复溶后，添加赋形剂甘露醇，稳定剂精氨酸、海藻糖，稀释剂去离子水，复配组合物，所述组合物是医疗器械组合物、保健品组合物、化妆品组合物。
[0029](三)有益效果
[0030]与现有技术相比，本专利技术提供了一种融合因子配方组合工艺，具备以下有益效果：
[0031]通过添加GST促溶标签，明显提高目的蛋白的可溶性表达，目的蛋白表达量占总蛋白的21.58％，可达0.13mg/mL，通过GST亲和层析与阴离子交换层析两步纯化后目的蛋白的纯度达到92.57％，整个提取工艺简单，操作成本低及纯度高，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
具体实施方式
[0032]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例一：一种融合因子配方组合工艺，包括以下步骤：
[0034]1)酵母菌扩培发酵；
[0035]2)菌体收集破碎分离纯化；
[0036]3)凝胶分离纯化；
[0037]4)复配组合物。
[0038]酵母菌扩培发酵包括以下步骤：
[0039]A、从
‑
70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中35℃，210r/min，培养12h；
[0040]B、将菌液按照1:100转接至100mL的LB液体培养基中，35℃，210r/min，继续培养到OD600为0.6时；
[0041]C、加入1mol/L的异丙基β本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合因子配方组合工艺，其特征在于，包括以下步骤：1)酵母菌扩培发酵；2)菌体收集破碎分离纯化；3)凝胶分离纯化；4)复配组合物。2.根据权利要求1所述的一种融合因子配方组合工艺，其特征在于，所述酵母菌扩培发酵包括以下步骤：A、从
‑
70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入10mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中35
‑
38℃，210
‑
230r/min，培养12
‑
16h；B、将菌液按照1:100转接至100mL的LB液体培养基中，35
‑
38℃，210
‑
230r/min，继续培养到OD600为0.6
‑
0.8时；C、加入1mol/L的异丙基β
‑
D
‑1‑
硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，12
‑
20℃，210
‑
230r/min条件下继续诱导培养10
‑
14h，含穿膜肽的融合蛋白表达于菌种中。3.根据权利要求2所述的一种融合因子配方组合工艺，其特征在于，所述LB液体培养基中含100μg/mL氨苄青霉素。4.根据权利要求1所述的一种融合因子配方组合工艺，其特征在于，所述菌体收集破碎分离纯化包括以下步骤：A、将发酵液采用6000
‑
7200r/min室温离心8
‑
12min，收集菌体，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：易祥，
申请(专利权)人：广西福莱明生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：