本发明专利技术是一种病原菌液基薄层涂片检测试剂盒及其检测方法。检测试剂盒是由预处理液，液化剂，稀释液，鉴别染色液和耗材组成。这种检测试剂盒的检测方法，是在检测样品中加入强碱性预处理液和液化剂进行样品的均相化处理，再加入稀释剂，作液基离心沉淀薄层制片，得到多张分布均匀的病原菌液基薄层涂片，然后进行鉴别染色，根据病原菌的染色反应、形态学和排列方式的观察与计算，就可对样品中多种病原菌作出检测结果。本发明专利技术建立了一种病原菌液基薄层涂片快速灵敏的检测方法，整个过程一小时内就可完成，检测方法又比较简单，具有较大的临床推广价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。这种试剂盒的检 测方法，主要是将检测样品用预处理液和液化剂作均相化处理，再使用稀释液稀释后作离 心沉淀制片，得到多张病原菌液基薄层涂片，然后进行鉴别染色，根据病原菌的染色反应、 形态和排列方式就可对样品中多种病原菌作出快速检测。
技术介绍
呼吸系统感染是一种较为常见的疾病。在肺部感染的各种病原中，以细菌占首位 (成人约占80%，儿童约占60% )，其次为病毒、支原体等(丛玉隆主编，医家金鉴，检验医 学卷(下)，军事医学科学出版社，PP 974-981)。在上呼吸道感染中较重要的肺炎链球菌 在人体抵抗力降低时引起疾病，尤其对老人和儿童，最严重可致肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳 炎、鼻窦炎等。在医院内感染所致的细菌性肺炎中，肺炎球菌约占30%，金黄色葡萄球菌约 占10%，而需氧革兰染色阴性杆菌(绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、 肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌等)则增至约50%。其余为耐青霉素G的金黄色葡萄球菌、真 菌和病毒，一些以往较少报道的如军团菌等相继出现，革兰染色阴性杆菌肺炎的病死率仍 高(30-40% )，老年及危重患者尤为难治。近年来肺真菌病发病率也逐渐上升，如白色念珠 菌、曲霉菌、放线菌等。在痰液样品中检查病原菌的传统方法是直接涂片法，因该方法简便易行，是目前 各实验室一个重要的检查手段。该方法是将经部分挑选的痰液样品手工涂在玻片上，然后 通过痰液样品的鉴别染色观察结果。鉴别染色对于大多数病原体的初步分类有极大的帮 助，革兰染色和抗酸染色是鉴别染色的范例，但革兰染色只能用于少数例如肺炎链球菌和 白色念珠菌的鉴定，抗酸染色也仅用于特殊的细菌群如分枝杆菌属等的鉴定。该方法的缺 点是涂片不均勻，背景较脏，检测灵敏度低，这主要是被痰液以及被细胞包裹的病原菌不易 释放，能检测出的病原菌数量较少的原因。因此目前临床诊断治疗时主要还是依靠培养鉴 定方法，但是培养鉴定所需时间较长，不能满足临床的快速需要。在实验室中常用人体脱落细胞液基薄层涂片技术用于肿瘤细胞的形态观察，例如 宫颈癌和肺癌病理细胞的诊断。其通常的操作步骤是先将检测样品例如采样后的宫颈刷或 痰液放入含有酒精成分的细胞保存液中，完成样品中脱落细胞形态的固定和均相化，以防 止脱落细胞的自我降解。再将上述已经均相化的检测样品和粘附剂混合后加入到离心沉淀 制片组合中(离心沉淀制片组合是由中空离心管的底部和在其下面的载玻片无缝连接，并 共同固定在甩片架底座上组成)，并放入吊篮式离心机的吊蓝中，以小于1，000转/分转速 离心进行离心沉淀制片。在离心沉淀制片过程中完成对人体脱落细胞的浓缩并使之黏附在 载玻片上，得到分布均勻的细胞薄层涂片。离心结束后弃上层液并将离心沉淀制片组合倒 扣浙干，卸下载玻片烘干。然后进行鉴别染色，通常一个样品得到一张涂片，做一种染色即 可。例如需要观察宫颈癌细胞常用巴氏染色，肺癌细胞常用HE染色。为了解决目前临床上 存在的不能为含有病原菌的样品快速灵敏地提供病原菌感染检测结果的问题，本专利技术在上述人体脱落细胞液基薄层涂片技术的基础上进行改进，提供一种病原菌液基薄层涂片检测 试剂盒及其检测方法，可对样品中多种病原菌作出快速检测。
技术实现思路
本专利技术涉及。本专利技术病原菌液 基薄层涂片检测试剂盒是由预处理液，液化剂，稀释液，鉴别染色液和耗材组成。这种病原 菌液基薄层涂片检测试剂盒的检测方法，是在检测样品中加入强碱性液基细胞学病原菌样 品预处理液和液化剂，通过搅拌实现样品的均相化。再使用稀释剂对已液化的样品进行稀 释后，作离心沉淀制片，得到多张分布均勻的病原菌液基薄层涂片。然后进行鉴别染色，根 据病原菌的染色反应、形态学和排列方式就可对检测样品中多种病原菌作出快速灵敏的检 测。本专利技术病原菌液基薄层涂片检测试剂盒的检测方法包含下列步骤(1)取样取含病原菌的样品。样品可以是痰液、支气管灌洗物、胸腹水、脓液和创伤感染组 织、脑脊液、关节液、尿液或粪便。如果是痰液，则可取其全部作为样品。如果是体积较大的 液态样品，则可取其部分作为检测样品。粪便则在去污萃取后，和尿液一样再通过高速离心 取得病原菌样品。样品中含有的病原菌主要是二类(a)细菌例如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、 结核杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、军团菌、B型流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆 菌、肺炎克雷伯菌、肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌等；(b)真菌例如白色念珠菌、曲霉菌、放线 菌等。(2)样品的均相化处理在样品中以样品和预处理液1 3-20的体积比加入预处理液，以样品和液化剂 1 0-5的体积比加入液化剂，和磁力搅拌子一起放在磁力搅拌仪上加热45-65°C搅拌5-30 分钟，转速为1，000-2，000转/分，进行样品的均相化处理，加热搅拌能加速液化。预处理 液是取之于由5-50ml氨水(密度0. 88g/ml) U-IOg氯化钠及余量为水配制的IOOml混合 液。液化剂可以是蛋白酶，例如0. 5-5重量％糜蛋白酶或0. 5-5重量％胃蛋白酶，也可以是 巯基还原剂，例如浓度为3. 0-30. Omg/ml巯基乙醇、浓度为4. 0-40. Omg/ml β -巯基乙醇、 浓度为3. 5-35. Omg/ml 1,4- 二巯基丁二醇、浓度为4. 5-45. Omg/ml 二硫赤藓糖醇、浓度为 5. 0-50. Omg/ml 二硫苏糖醇等。样品的均相化处理使样品发生物理变性和化学变性。物理变性主要是对粘稠液例 如痰液、脑脊液等样品进行加热搅拌剪切实现勻浆化。液化剂作为化学变性剂，能打开样品 中蛋白间的化学键，特别是肽键、氢键和二硫键，增加样品的水溶性，让被蛋白包裹的病原 菌从中释放。强碱性的预处理液能裂解样品中的脱落细胞特别是肺泡巨噬细胞膜和中性粒 细胞等白细胞，让被细胞包裹的病原菌从中释放，例如结核杆菌和军团菌。可依样品的粘稠 程度加入液化剂，如果粘稠程度高体积大，可多加些液化剂，如果是胸腹水或尿液，液化剂 的使用量可适当减少或不加。所述的预处理液和液化剂分开包装，并在使用时混合，是为了 防止液化剂失活。(3)液基离心沉淀薄层制片取上述已均相化的样品和稀释液按1 0-6的体积比混合，加入离心沉淀制片组 合中的离心管中。稀释液为0.5-5重量％的氯化钠溶液，能使背景干净和有利于样品中病 原菌的形态固定和检测，但对于已经很稀薄的样品，例如支气管灌洗物，就不需用稀释液稀 释。离心沉淀制片组合是由中空离心管的底部和在其下面的载玻片无缝连接，并共同固 定在甩片架底座上组成。然后将离心沉淀制片组合分别放入吊篮式离心机的吊蓝中，以 1，000-3, 000转/分转速离心5-15分钟，在离心沉淀制片过程中完成对病原菌的浓缩和形 态固定并使之黏附在载玻片上，得到多张分布均勻的薄层涂片。离心结束后弃上层液，将离 心沉淀制片组合倒扣浙干水分，卸下载玻片30-70°C烘3-10分钟。样品中的细菌个体很小， 不容易沉淀黏附在玻片上，因此需要较高的离心转速(1，000-3, 000转/分)。如同一样品 一次所需离心制片的数量超过吊蓝能存放的数量，可作两次以上离心即可得到。(4)鉴别染色在含同一样品的多张载玻片上鉴别染色使用何种染色液进行反应，依据细菌种类 和可检出的特点，例如特有的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺坚慧，潘曙明，程振球，吴增斌，刘佳，江静，
申请(专利权)人：贺坚慧，
类型：发明
国别省市：31
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