快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒，所述检测方法：获得至少一种荧光引物，其在退火之后形成茎环结构，且其5

【技术实现步骤摘要】
快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，涉及基因测序技术，具体是涉及一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNA—dependent DNA polymerase，DNA pol)，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。此酶最早是美国科学家Arthur Komberg于1957年在大肠杆菌中发现的，被称为DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ，简称polⅠ)以后陆续在其他原核生物及真核生物中找到了多种DNA聚合酶。这些DNA聚合酶的共同特征为：
①
具有5
’→3’
聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5
’→3’
方向合成。
[0003]随着测序技术的不断发展，目前市场上存在一代、二代、三代多种测序技术平台，而其中二代测序平台以其通量高、准确性高、成本相对较低的特点成为市场上商业化最为成功的测序平台。生产二代测序平台的代表公司有illumina和深圳华大智造，两家公司的二代测序技术都是通过在碱基上修饰荧光基团，然后在测序过程中利用DNA聚合酶聚合带荧光的碱基(dNTP)，从而通过荧光成像的方法去识别出每个碱基的信息达到测序的目的。由于测序过程使用的荧光dNTP底物与常规PCR技术所使用的dNTP底物有一定的区别，因此二代测序过程使用的DNA聚合酶也与PCR使用的酶有一定区别，往往需要对一些聚合酶进行改造，而检测DNA聚合酶活性，筛选出适合聚合以及能快速聚合带荧光碱基底物的DNA聚合酶是二代测序技术中较为关键的一环。
[0004]现有技术往往通过直接在测序平台上进行测序来检测DNA聚合酶的活性，检测通量低，一次往往只能检测1
‑
2种聚合酶，而且时间较长，大约需要8
‑
24h，成本较高。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的在于提供一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法和试剂盒，所述检测方法不但能够很好地检测DNA聚合酶活性以及对不同碱基的偏好性，还可以一次性提高检测的DNA聚合酶的数量，减少检测时间，同时相对于测序的检测手段来说成本显著降低。
[0006]实现上述目的的技术方案包括如下。
[0007]本专利技术的第一个方面，是提供一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法，包括以下步骤：S1.获得至少一种荧光引物，所述荧光引物的在退火之后形成茎环结构，茎环结构之外，其5
’
末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自A、C、G、T种任一种；所述荧光引物的5
’
末端修饰了荧光淬灭基团；
[0008]S2.将待检测的DNA聚合酶、所述荧光引物、至少一种荧光基团标记碱基底物(dNTP)混合至一起构成检测体系，进行聚合反应，并同时进行荧光检测，所述碱基底物选自dTTP、dCTP、dATP、dGTP，且相应地与所述荧光引物的未配对的碱基能够配对。
[0009]在其中一些实施例中，所述荧光引物的碱基长度为39
‑
51，更优选为41
‑
47。
[0010]在其中一些实施例中，所述二代测序DNA聚合酶是对带有修饰基团的非天然dNTP具有聚合活性的聚合酶，包括KOD聚合酶、9N聚合酶及其相应突变体，以及其他潜在的突变之后对非天然dNTP具有聚合活性的聚合酶关酶(例如9N(exo
‑
)DNA Polymerase)。
[0011]在其中一些实施例中，所述检测仪器是能提供聚合反应，且扫描样本在不同时间点的荧光信号，且同时能扫描多个样本的设备，优选为酶标仪。
[0012]在其中一些实施例中，所述荧光检测的时间为15
‑
30min。
[0013]在其中一些实施例中，所述荧光引物在检测体系中的浓度为1.5μM
‑
2.5μM，更优选为1.8μM
‑
2.2μM，进一步优选为1.9μM
‑
2.1μM。
[0014]在其中一些实施例中，所述碱基底物在检测体系中的浓度为0.6μM
‑
1.5μM,更优选为0.8μM
‑
1.2μM，进一步优选为0.8μM
‑
1.0μM。
[0015]在其中一些实施例中，荧光基团最常用的比如FAM(carboxy
‑
fluorescein，羧基荧光素)、TET(Tetrachloro fluorescein，四氯
‑6‑
羧基荧光素)、HEX(Hexachloro fluorescein，六氯
‑6‑
甲基荧光素)、VIC、5
‑
TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明)、ROX(X
‑
rhodamine，罗丹明X)、Texas Red
‑
X(德克萨斯红)、cy3(Indodicarbocyanine 3，吲哚菁类染料3)、cy5(Indodicarbocyanine 5，吲哚菁类染料5)、JOE(2，7
‑
二甲基
‑
4，5
‑
二氯
‑6‑
羧基荧光素)。
[0016]在其中一些实施例中，荧光淬灭基团最常用的比如BHQ(Black Hole Quencher)系列，Dabcyl(4
‑
(4
’‑
恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)、Eclipse等。
[0017]本专利技术的第二个方面，是提供一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括：至少一种荧光引物，所述荧光引物的组成为在退火之后形成的茎环结构和5
’
末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自A、C、G、T种任一种，所述荧光引物的5
’
末端修饰了荧光淬灭；和
[0018]至少一种荧光标记碱基底物，所述碱基底物为dTTP、dCTP、dATP、dGTP中的任一种。
[0019]在其中一些实施例中，所述荧光引物包括4种不同的5
’
末端突出一个未配对的碱基，分别为A、C、G、T碱基。
[0020]在其中一些实施例中，所述碱基底物为dTTP、dCTP、dATP、和dGTP(dNTP)。
[0021]在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括酶标板。
[0022]本专利技术所述检测二代测序DNA聚合酶活性的方法，通过通过能够形成茎环结构的引物序列，引物5
’
末端的位置带有突出的选自A、C、G、T的一种碱基和荧光淬灭基团，待测DNA聚合酶聚合测序用荧光碱基底物来检测DNA聚合酶对测序dNTP的活性，荧光淬灭基团对聚合上引物的dNTP的荧光基团具有淬灭效应的方式检测聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测二代测序DNA聚合酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获得至少一种荧光引物，所述荧光引物的在退火之后形成茎环结构，茎环结构之外，其5
’
末端突出一个未配对的碱基，所述未配对的碱基选自A、C、G、T种任一种；所述荧光引物的5
’
末端修饰了荧光淬灭基团；S2.将待检测的DNA聚合酶、所述荧光引物、至少一种荧光基团标记碱基底物混合至一起构成检测体系，进行聚合反应，并同时进行荧光检测，所述碱基底物选自dTTP、dCTP、dATP、dGTP，且相应地与所述荧光引物的未配对的碱基能够配对。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光引物的碱基长度为39
‑
51，更优选为41
‑
47。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述二代测序DNA聚合酶是对带有修饰基团的非天然dNTP具有聚合活性的聚合酶，优选地，包括KOD聚合酶、9N聚合酶及其相应突变体。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述荧光检测的时间为15
‑
30min。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述方法，其特征在于，所述荧光引物在检测体系中的浓度为1.5μM
‑
2.5μM，更优选为1.8μM
‑
2.2μM，进一步优选为1.9μM
‑
2.1μM。6.根据权利要求1
‑
4任一项所述方法，其特征在于，所述碱基底物在检测体系中的浓度为0.6μM
‑
1.5μM,更优选为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：傅德丰，王谷丰，刘二凯，赵陆洋，
申请(专利权)人：深圳赛陆医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：