MBs-ssDNA-hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用制造技术

本发明专利技术属于碱性磷酸酶检测技术领域，具体涉及MBs

【技术实现步骤摘要】
MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用


[0001]本专利技术属于碱性磷酸酶(IAP)检测
，具体涉及MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用。

技术介绍

[0002]炎症性肠病(IBD)是一种以胃肠道炎症性紊乱为特征的免疫介导的慢性疾病，随着生活水平的提高和饮食结构的改变，IBD的发病率逐年升高。目前的研究认为IBD主要与遗传、微生物、免疫、环境等因素有关。IBD的临床诊断是基于临床指标(症状和实验室检查)，内窥镜检查，活检和非侵入性成像技术，如计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)的综合评估。内镜检查被认为是IBD的金标准诊断方法，但其具有侵入性，且检查会引起明显的不适，限制了其在IBD早期筛查中的可接受性。因此，建立一种简单、无创、可靠的IBD辅助诊断方法，对于IBD的早期筛查十分必要。近年来，分子标志物如血清学、组织学和粪便标志物等逐渐应用于IBD的早期诊断。其中粪便样本采集方便，普遍为患者所接受，大大降低了可能对患者造成的身体或心理的创伤。同时粪便样本与肠道直接接触，因此粪便生物标志物对于肠道炎症有更高的特异性。近年来，人们探索了几种粪便标志物在IBD诊断和监测中的作用，如基质金属蛋白酶9(MMP 9)、钙卫蛋白、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2、碱性磷酸酶等。肠道碱性磷酸酶(IAP)是金属酶超家族的一员，可催化水解去除核酸、蛋白质等多种生物分子中的磷酸盐。IAP主要由肠细胞分泌，在肠腔和血流中表达，被认为是维持肠道稳态的重要粘膜因子。多项研究表明，IBD炎症黏膜内的IAP浓度明显低于健康人。目前，已经报道了多种方法来监测IAP活性，如比色法、荧光法、电化学法和表面增强拉曼光谱法(SERS)。然而，这些方法都需要特定的设备和专业的操作。
[0003]目前市场上已有多种即时检测(POC)设备被用于检测生物标志物，如侧流免疫测定(LFA)、温度计、个人尿酸计和个人血糖计(PGM)。其中，LFA作为一种成熟的检测技术，具有稳定、可靠、安全、简便等优点。但是大多数传统的试纸都是基于双抗体夹心原理，双抗体的使用无疑增加了试纸开发的成本和难度。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种MBs
‑
ssDNA
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hCG探针、试剂盒及其在检测IAP中的应用。
[0005]本专利技术的第一方面，提供一种MBs
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ssDNA
‑
hCG探针，所述探针由序列如SEQ ID NO.1所示的ssDNA将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。
[0006]进一步的，所述ssDNA的3
′
端标记生物素，5
′
端修饰有羧基。
[0007]本专利技术的第二方面，提供所述MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针的制备方法，包括以以下步骤：
[0008]1)将所述链霉亲和素修饰的磁珠与ssDNA于buffer 1中反应1
‑
1.5h，反应完成后除去过量的ssDNA，得到MBs
‑
ssDNA；
[0009]2)将所述MBs
‑
ssDNA分散于MES buffer中，依次加入1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo
‑
NHS)溶液，混匀后反应20
‑
25min，用PBS buffer洗涤后分散于PBS buffer中，加入人绒毛膜促性腺激素(hCG)溶液，过夜反应，之后去除未连接的hCG分子，得到MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针；
[0010]进一步的，步骤1)
‑
2)中反应温度均为室温。
[0011]更进一步的，所述Buffer 1的组成为100mM Tris，1M NaCl，HCl调pH至7.5；所述MES buffer的组成为0.1M MES，0.5M NaCl，pH至6.0；所述PBS buffer的组成为0.1M Na2HPO4·
12H2O与NaH2PO4·
2H2O，0.1M NaCl，pH7.2。
[0012]本专利技术的第三方面，提供一种检测生物传感器，包括Cas12a
‑
crRNA复合物、dsDNA以及所述的MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针；
[0013]所述Cas12a
‑
crRNA复合物由Cas12a和crRNA孵育结合得到，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示；
[0014]所述dsDNA由SEQ ID NO.3所示的核酸序列与其反向互补的核酸序列组成，SEQ ID NO.3所示的核酸序列5
′
端磷酸化修饰。
[0015]本专利技术的第四方面，提供一种试剂盒，包括妊娠试纸条和所述的检测生物传感器。
[0016]本专利技术的第五方面，提供述试剂盒在非诊断目的的检测碱性磷酸酶中的应用。
[0017]本专利技术具有以下有益效果：
[0018]本专利技术提出了一种靶标诱导dsDNA探针去磷酸化，以触发Cas12a的反式切割活性来检测IAP的方法。如图1所示，首先通过一段单链DNA(ssDNA)将人绒毛膜促性腺激素(hCG)偶联到链霉亲和素包覆的磁珠(MBs)上，构建了MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针，其中ssDNA 3
′
端标记生物素，5
′
端修饰有羧基(COOH)。同时设计了一条dsDNA探针作为IAP的识别底物和CRISPR
‑
Cas12a的激活剂，其中dsDNA的一条链在5
′
端进行磷酸化修饰。当靶标IAP存在时，IAP催化dsDNA探针去磷酸化，从而保护dsDNA免受体系中核酸外切酶(λexo)的切割，保留的完整dsDNA与CRISPR
‑
cas12a/crRNA结合，从而激活Cas12a酶的反式切割能力。最终，激活的Cas12a开始切割hCG和MBs之间的ssDNA，将hCG分子释放到溶液中。磁吸附后，上清液中的hCG能够在妊娠试纸条上显色。在没有IAP的情况下，dsDNA中5
′‑
磷酸化的单链DNA被λexo切割。被切割降解的dsDNA无法激活Cas12a的活性，因此无法切割MBs
‑
ssDNA
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hCG探针，试纸条测试线不显示任何颜色。因此，IAP的定量可以根据妊娠试纸的颜色深度来实现。
附图说明
[0019]图1为MBs
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MBs
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ssDNA
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hCG探针，其特征在于，所述探针由序列如SEQ ID NO.1所示的ssDNA将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。2.根据权利要求1所述的MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针，其特征在于，所述ssDNA的3
′
端标记生物素，5
′
端修饰有羧基。3.权利要求1所述MBs
‑
ssDNA
‑
hCG探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将所述链霉亲和素修饰的磁珠与ssDNA于buffer 1中反应1
‑
1.5h，反应完成后除去过量的ssDNA，得到MBs
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ssDNA；2)将所述MBs
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ssDNA分散于MES buffer中，依次加入1
‑
乙基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐溶液，混匀后反应20
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25min，用PBS buffer洗涤后分散于PBS buffer中，加入人绒毛膜促性腺激素hCG溶液，过夜反应，之后去除未连接的hCG分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明真，贾真真，张明鑫，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：