一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法及应用，属于纳米生物技术领域，该方法利用聚集沉淀交联法将生物活性蛋白直接包覆在纳米颗粒表面，并利用其特性将特异性抗体定向自标记免疫纳米微球。与现有技术相比，该方法通过聚集沉淀交联法包覆一层只对抗体Fc段反应的蛋白和利用蛋白的生物活性将抗体定向固定在纳米微球表面，该定向免疫纳米微球能够使与纳米微球结合的抗体的Fab区域呈现在纳米微球表面，从而提高免疫微球上抗体的生物活性，提高检测的灵敏度，解决现有技术中，由于位阻原因或活化官能团交联等，导致抗体的反应活性降低的技术问题。反应活性降低的技术问题。反应活性降低的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法及应用


[0001]本专利技术属于纳米生物
，尤其涉及一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法及应用。

技术介绍

[0002]在将纳米颗粒与抗体的偶联过程中，保证抗体的结合位点的正确方向性及可用性是影响探针生物活性的关键因素。
[0003]目前对其常用的标记方法是在其表面覆盖疏水性聚合材料，在提供交联基团的同时还可防止纳米颗粒的聚集。采用重氮法、碳化二亚胺法、马来酰亚胺酯法、混合酸酐法、半琥珀酸酯法等使抗体上的氨基、羧基、巯基、羟基等与高分子聚合物交联基团共价偶联至纳米酶表面。但这些方法在标记的时候是随机地将抗体偶联到标记物上，抗体的活性很可能由于标记方法的原因而被掩蔽或失活。
[0004]葡萄球菌A蛋白（SPA）是一种生物活性蛋白，它只与抗体的结晶片段（Fc）有特异亲和力，而与抗体的抗原结合片段（Fab）不反应，不影响抗体与抗原的反应，利用它可以实现抗体的定向标记。
[0005]对于SPA与纳米颗粒的偶联，如果通过纳米酶表面覆盖的疏水性聚合材料偶联，首先，会导致探针的标记次数多粒径大捕捉抗原效率降低；其次，在纳米酶表面覆盖的疏水性聚合材料的交联基团有限对SPA的标记率低，那么能结合上的抗体就会更少。
[0006]经过分析，现有技术中存在如下技术问题：1）抗体与纳米颗粒的标记是通过在其表面覆盖的疏水性聚合材料，通过提供交联基团达到与抗体的标记。在抗体与纳米颗粒标记时，通过重氮法、碳化二亚胺法、马来酰亚胺酯法、混合酸酐法、半琥珀酸酯法等使抗体上的氨基、羧基、巯基、羟基等与高分子聚合物交联基团共价偶联至纳米酶表面，因此标记后的抗体Fab段的方向是随机的，很可能由于位阻原因，影响抗体的反应活性。
[0007]2）纳米粒子表面包覆的疏水性材料上的交联基团有空间位阻的原因导致可标记抗体的官能团丰度小，标记的抗体量少。抗体的Fab区上的官能团如果与疏水性材料的官能团反应，当抗体失活，虽然标记上，但是没有反应活性。活化的官能团会在自身引起交联，也会使抗体失活。
[0008]如何设计一种新的标记的方法解决上述技术问题，成为当前该
的难题。
[0009]经过大量的实验和思考，意外发现：纳米颗粒可自发吸附溶液中蛋白质（包括SPA蛋白），再加入蛋白沉淀剂促进蛋白质聚集沉淀到纳米颗粒表面，用温和的交联剂（戊二醛或EDC）可将蛋白质高效标记到纳米颗粒表面，因此，将SPA聚集沉淀交联到纳米颗粒表面，再利用其生物活性将可将抗体定向标记的技术方法成为解决该技术问题的可行技术方案。

技术实现思路

[0010]针对上述技术问题，本专利技术提供了一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方
法及应用，该方法通过聚集沉淀交联法包覆一层只对抗体Fc段反应的蛋白和利用蛋白的生物活性将抗体定向固定在纳米微球表面。
[0011]本专利技术通过以下技术手段解决上述问题：一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤及操作方法：步骤一、利用聚集沉淀法将生物活性蛋白直接包覆在纳米颗粒表面，具体包括如下操作方法：1）选取0.1
‑
0.3mg生物活性蛋白SPA和10
‑
20mg直径50
‑
1000nm的纳米颗粒放入0.2
‑
0.3mol/L的pH为中性的缓冲溶液中，并确保混合溶液的总体积为1
‑
1.2ml，混匀吸附55
‑
65min；需要说明的是，溶液的体积与蛋白质及纳米颗粒的组成可等比例增加。
[0012]2）在室温环境下，向混合溶液逐滴加入0
‑
2℃的无水乙醇2
‑
4ml或饱和硫酸铵溶液2
‑
5mL，将混合溶液充分搅拌15
‑
25min，确保SPA蛋白沉淀到纳米酶表面；3）向上述混合溶液中加入0.8
‑
0.9ml的20
‑
25%戊二醛或终浓度1%
‑
5%的EDC碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌55
‑
65min；4）使用缓冲液离心洗涤混合溶液、以除去没有沉淀交联到纳米颗粒表面的蛋白；步骤二、制备定向自标记免疫纳米微球，具体包括如下操作方法：1）将步骤一中所得的纳米颗粒用中性磷酸盐缓冲液稀释到0.1
‑
2%的浓度，得活化的纳米颗粒；2）向上述纳米颗粒中加入特异性的抗体,使抗体终浓度为0.1
‑
5.0mg/ml，室温反应1
‑
2小时；3）加入浓度大于2.0mg/ml的酪蛋白或SP2/0单抗，并在室温55
‑
65min封闭掉多余的SPA结合位点和非特异性结合位点；4）离心洗涤上述纳米颗粒即可得到相应的特异性定向自标记免疫纳米微球。
[0013]优选的，使用中性缓冲液离心洗涤混合溶液包括如下操作步骤：1）使用PH=7.0
‑
7.3、0.15
‑
0.25M的磷酸盐缓冲液离心洗涤混合溶液一次，再加入0.1
‑
0.2mg的SPA封闭室温搅拌55
‑
65min；2）使用PH=7.0
‑
7.3、0.15
‑
0.25M的磷酸盐缓冲液离心洗涤混合溶液一次，以除去未反应的SPA；3）使用PH=7.0
‑
7.3、0.15
‑
0.25M的中性缓冲液调整混合溶液中纳米颗粒的浓度，使浓度范围为0.1%
‑
2%，并置于4℃储存备用。
[0014]进一步的，所述定向自标记免疫纳米微球应用在免疫侧向流或者免疫渗滤及免疫比浊检测法中。
[0015]进一步的，应用于内含有所述定向自标记免疫纳米微球的试剂盒。
[0016]进一步的，所述定向自标记免疫纳米微球由铁磁性物质、乳胶高分子物质、荧光材料或纳米高分子材料制成。
[0017]进一步的，抗体可以偶联荧光物质同时纳米微球也可以是荧光物质，内含有所述定向自标记免疫纳米微球的试剂盒适用200
‑
1000nm波长的检测。
[0018]进一步的，内含有所述定向自标记免疫纳米微球的试剂盒适用于透射仪和散射比
浊仪。
[0019]专利技术的一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法及应用具有以下有益效果：1）该方法利用纳米颗粒对蛋白自发吸附的性质，将SPA蛋白吸附到纳米颗粒表面，然后又利用蛋白质沉淀剂（冷乙醇/冷丙酮或者硫酸铵等）将溶液中的蛋白质聚集到纳米颗粒表面，然后加上温和的交联剂如戊二醛或者EDC将蛋白固定到纳米颗粒表面，然后利用SPA只对抗体Fc段反应，不与Fab段反应的反应特性，将抗体定向固定。
[0020]2）该方法使用生物活性物质SPA蛋白，将抗体定向，同时使用聚集沉淀交联法将SPA高效温和固定在纳米颗粒表面，纳米颗粒无需预处理。
[0021]3）该定向免疫纳米微球能够使与纳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于纳米微球的高效定向标记抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤及操作方法：步骤一、利用聚集沉淀法将生物活性蛋白直接包覆在纳米颗粒表面，具体包括如下操作方法：1）选取0.1
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0.3mg生物活性蛋白SPA和10
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20mg直径50
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1000nm的纳米颗粒放入0.2
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0.3mol/L的pH为中性的缓冲溶液中，并确保混合溶液的总体积为1
‑
1.2ml，混匀吸附55
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65min；2）在室温环境下，向混合溶液逐滴加入0
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2℃的无水乙醇2
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4ml或饱和硫酸铵溶液2
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5mL，将混合溶液充分搅拌15
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25min，确保SPA蛋白沉淀到纳米酶表面；3）向上述混合溶液中加入0.8
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0.9ml的20
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25%戊二醛或终浓度1%
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5%的EDC碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌55
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65min；4）使用缓冲液离心洗涤混合溶液、以除去没有沉淀交联到纳米颗粒表面的蛋白；步骤二、制备定向自标记免疫纳米微球，具体包括如下操作方法：1）将步骤一中所得的纳米颗粒用中性磷酸盐缓冲液稀释到0.1
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2%的浓度，得活化的纳米颗粒；2）向上述纳米颗粒中加入特异性的抗体,使抗体终浓度为0.1
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5.0mg/ml，室温反应1
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2小时；3）加入浓度大于2.0mg/ml的酪蛋白或SP2/0单抗，并在室温55
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65min封闭掉多余的SPA结合位点和非特异性结合位点；4）离心洗涤上述纳米颗粒即可得到相应的特异性定向自标记免疫纳米微球。2.根据权利要求1所述的一种适用于纳米微球的高...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵彭花，左宇霏，
申请(专利权)人：陕西省人民医院陕西省临床医学研究院，
类型：发明
国别省市：