以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系创建及应用制造技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，涉及以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系创建及应用。首先诱导油菜毛状根；随后提取根肿菌休眠孢子悬浮液并消毒；将消毒后的根肿菌加入到人工培养基中，与毛状根共培养；对根肿菌与毛状根共培养体系中的培养基类型、碳源及浓度、培养基pH值、根肿菌接种量的培养条件进行系统优化，筛选出最适合根肿菌与毛状根共培养的培养条件；提取毛状根中的休眠孢子接种油菜植株，鉴定毛状根中根肿菌的致病性；通过传代培养根肿菌在油菜毛状根中的传代稳定性。本发明专利技术的发明专利技术点在于：组织培养体系中的培养基为MS半固体培养基+3.38％蔗糖+3％葡萄糖，pH5.89；接种量为1.96mL/L.培养基。接种量为1.96mL/L.培养基。

【技术实现步骤摘要】
以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系创建及应用


[0001]本专利技术属于植物离体培养
，具体涉及以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系的构建及应用。

技术介绍

[0002]根肿病是一种由原生动物有孔虫界寄生病原菌根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)引起的世界性重要土传病害，主要危害十字花科植物(Dixon G R.The occurrence and economic impact of Plasmodiophora brassicae and clubroot disease.J Plant Growth Regul.,2009,28:194
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202.)。感染根肿菌的植株根部会逐渐膨大形成大小不一的肿瘤，使植株对水分、营养元素的吸收和运输受阻，影响植物生长，导致作物的产量和质量受到严重损失。根肿菌休眠孢子抗逆性极强，它可以在酸性土壤中存活10年以上，被污染的土壤在此期间不再适合种十字花科作物，严重制约了十字花科作物的可持续性发展(Dixon G R.Plasmodiophora brassicae(Clubroot):a plant pathogen that alters host growth and productivity.J Plant Growth Regul.,2009,28(3):193
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193.)。近年来，根肿病已开始严重威胁到我国油菜等十字花科作物主产区的正常生产，给我国农业经济发展和农民增收带来巨大损失。因此，根肿菌的研究迫在眉睫。
[0003]目前全世界关于根肿菌的致病机制、与寄主的互作机理等基础研究比较落后，这主要与它的专性活体寄生性有关。大多数植物病原菌可以在培养基中保存和传代，为其生活史、基因组和致病机制等基础研究提供了很大的便利。作为专性活体寄生病原菌，根肿菌不能离开宿主独自生长，这为抗根肿菌基础研究的开展带来了极大的困难。自根肿病的相关研究开展以来，根肿菌的培养主要依靠活体植物培养法。活体植物培养法是获得根肿菌休眠孢子的常用方法，大多选用基因组小、易转化且周期短的模式植物拟南芥为寄主。该方法能够获取大量成熟孢子，但是仍存在一些弊端，如培养过程中易受外界环境影响及杂菌污染、不能长期保存菌种等(Luo H C,et al.An improved culture solution technique for Plasmodiophora brassicae infection and the dynamic infection in the root hair.Australas Plant Path,2014,43:53
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60；Donald E C and Porter I J；Asano T,Kageyama K.Growth and movement of secondary plasmodia of Plasmodiophora brassicae in turnip suspension
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culture cells.Plant Pathol.,2006,55(1):145
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151.)。鉴于根肿菌活体植物培养存在的上述缺陷，有必要构建根肿菌的离体培养体系，促进油菜抗根肿病研究的开展。毛状根是由发根农杆菌诱导、能够在无激素培养基上自主生长的、多根毛、多分枝的无向地性的不定根。以毛状根为寄主培养根肿菌，能够有效避免环境中的杂菌污染，实现根肿菌的传代和保存；另一方面，毛状根具有根的结构，为根肿菌完成生活史提供了必要条件。因此毛状根是理想的根肿菌离体培养寄主。
[0004]近年来，毛状根已成为植物根部寄生病原微生物培养及理论研究的良好材料，如利用毛状根建立丛枝菌根真菌培养体系、利用毛状根培养根瘤菌，获得更多根瘤、利用毛状根培养根结线虫，便于筛选目的抗虫基因等。关于油菜毛状根在根肿菌培养中的应用，早期
一些研究者也进行了探索，但目前还没有成功的报道。Graveland等尝试利用甜菜、油菜、甘蓝等植物诱导毛状根进行根肿菌培养，但发病率低且未观察到成熟的休眠孢子(Graveland R,Dale P and Mithen R.Gall development in hairy root cultures infected with Plasmodiophora brassicae.Mycol Res.,1992,96:225
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228.)。Asano等在芜菁毛状根进行根肿菌培养观察到毛状根肿瘤，但是该方法存在传代过程中发病率下降等缺点，故至今没有在根肿菌研究中应用(Asano T,Kodama A and Kageyama K.Susceptibility of hairy root lines of Brassica species to Plasmodiophora brassicae and in an in vitro subculture system.J Gen Plant Pathol.,2006,72(2):85
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91.)。见表1。
[0005]表1利用Asano T等(2006)的方法进行根肿菌培养的结果
[0006][0007]综上，目前仍然缺乏稳定高效的根肿菌离体培养和保存方法，为抗根肿菌的致病机制、与寄主的互作机理等基础研究的开展带来了极大的困难。另一方面，根肿菌存在明显的致病力分化现象，单一或小数生理小种的抗性品种在生产上很容易被淘汰，而根肿菌单孢分离技术难度大，加之无法长期稳定保存，严重影响了油菜抗根肿病育种的进展。因此，建立成熟的根肿菌离体培养体系对全面、深入开展根肿菌的基础研究，加快油菜抗根肿病育种进程，保证我国食用植物油的供给安全具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，利用油菜毛状根构建并优化根肿菌离体培养体系，并检测毛状根所培养的根肿菌的致病能力及传代能力，以期建立成熟的可以长期保存根肿菌的离体培养体系，为推动根肿菌的基础研究及抗病品种培育提供便利的培养方法。
[0009]本专利技术的总体技术方案如下所述：
[0010]首先诱导油菜毛状根；随后提取根肿菌休眠孢子悬浮液并对其进行消毒；将消毒后的根肿菌加入到人工培养基中，与毛状根共培养；对根肿菌与毛状根共培养体系中的培养基类型、碳源及浓度、培养基pH值、根肿菌接种量的培养条件进行系统优化，筛选出最适合根肿菌与毛状根共培养的培养条件；提取毛状根中的休眠孢子接种油菜植株，检测毛状根中根肿菌的致病性；最后，通过传代培养实验分析混合生理小种及单一生理小种根肿菌在油菜毛状根中的传代稳定性，证明根肿菌与油菜毛状根的共培养体系的可应用性。
[0011]本专利技术的具体步骤是：
[0012]首先将油菜品种westar(原种来自加拿大，一种公开使用的油菜品种，数据来自华中农业大学油菜数据中心：http://ibi.hzau.edu.cn/rapedata/va本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以油菜毛状根为寄主的根肿菌的离体培养方法，其特征在于，(1)将油菜种子进行消毒，并接种到MS+3％浓度的蔗糖，pH为5.8的固体培养基中，获得油菜无菌苗；(2)活化发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，并用其侵染油菜无菌苗的子叶及下胚轴进行毛状根的诱导，获得毛状根；(3)利用碱裂解法及抗生素法对根肿菌进行消毒，获得无菌且有活性的根肿菌休眠孢子；(4)即将消毒后的休眠孢子以浓度为3
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108/L的休眠孢子悬浮液，加入量为1.96mL/L培养基加入至MS+3.38％浓度蔗糖+3％浓度葡萄糖，pH为5.89的半固体培养基中，使根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王睿，王茂林，刘家齐，赵云，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：