一株产生物碱尖孢镰刀菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产生物碱尖孢镰刀菌及其应用，属于微生物发酵生产技术领域。所述镰刀菌，分类命名为Fusarium oxysporum MCF8，所述尖孢镰刀菌保藏号为CCTCC M 20231196，保藏日期为2023年7月5日。所述菌株从博落回根中筛选分离获得，培养7d达到生长稳定期。将所述菌株发酵，能够在短时间内快速高效发酵生产生物碱。所述菌株实现了利用真菌发酵生产生物碱，使其在工业化发酵生产生物碱方面具有极大的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株产生物碱尖孢镰刀菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物发酵生产生物碱类物质的
，具体涉及一株产生物碱尖孢镰刀菌及其应用。

技术介绍

[0002]生物碱(alkaloid)是一类含氮有机化合物，大多有较复杂的环状结构，氮原子多包含在环状结构中部分位于侧链上，多数具有碱性。生物碱类化合物具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、平喘、降血糖、镇痛等功能，是药物的有效成分。生物碱作为次级代谢物质广泛存在于许多的药用植物中。例如，茄加碱可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡，而芹菜素具有低的内在毒性和对癌细胞的显著抑制作用。苄基异喹啉类生物碱血根碱、白屈菜红碱等具有调节禽兽类肠道微生物的功能作用。目前，市场上流通的大部分生物碱类物质的获取依靠从罂粟科、木兰科、芸香科、小檗科等植物中直接提取，但是由于植物生长受季节、地域等环境因素的限制，以及市场需求量的逐年递增，从植物中提取生物碱类物质已近远远不能满足市场需求，同时通过常规化学合成生产这些产品物质比较复杂，仍然面临许多难题，导致生物碱类物质大规模工业化生产还有一定的距离。
[0003]近年来，由于基因测序技术的发展以及一系列分子生物学工具的开发应用，利用合成生物学的方法进行生物碱的生产得到迅速发展，但是，目前大部分研究仍然集中于产生物碱类物质工程菌的构建，利用合成生物技术改造大肠杆菌或酵母菌生产生物碱骨架物质，通过从头设计的途径构建、模块化改造途径优化和基因沉默系统的菌体代谢网络改造等一系列的合成生物学方法和策略，以实现生物碱类物质在工程菌中的高效异源合成。然而，工程菌株的建立存在许多问题待解决，如生物碱微生物合成途径中酶活性低和底物选择性差等导致的代谢流不可控、产率低等，酵母菌也是用的比较多的基因工程底盘菌之一，但利用酵母宿主设计次级代谢物途径时也存在一个问题，因为它们缺乏支持多基因(多顺式)转录单元的能力；此外，由于基因工程技术中基因只能来源于自然界中已存在的，且往往同时涉及到多个基因，这就意味着需要花费大量时间从自然界中筛选出理想的基因，同时组装这些基因时需考虑适配性等多个因素。《自然》杂志就曾发表“合成生物学面临的五大挑战”一文，指出，合成生物学进一步发展面临着技术创新和技术整合的瓶颈，需要克服五个方面的挑战：(1)许多生物组件未能准确描述，因此难以进行应用；(2)即使每个组件的功能已知，但当多个组件组装到一起，可能无法按事先想象的那样工作，基因网络难以预测；(3)随着基因网络变得越来越大，基因网络的建设和测试过程也变得更加艰巨；(4)合成的基因网络一经构建好并放入细胞，就可能对其宿主细胞产生无法预期的影响，许多组件开始表现出不兼容性；(5)细胞内的分子活性容易随机波动或形成噪音，生长条件的变化也会影响行为，而且长期由随机产生的基因突变可以损坏基因网络的功能。这些都可能导致人工合成的生命体系最终崩溃，因而这些存在的问题和挑战亟需解决。以上种种因素共同导致构建产目标生物碱工程菌株时存在许多问题亟需解决；本专利技术发现了一种尖孢镰刀菌，其在生物碱类物质工业发酵上具有巨大潜力。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是为了提供一种产生物碱类物质的尖孢镰刀菌及其应用，对于作为工业化发酵生产生物碱有着极大的应用前景。
[0005]为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种尖孢镰刀菌，分类命名为(Fusarium oxysporum)MCF8，所述尖孢镰刀菌，保藏号为CCTCC M 20231196，保藏日期为2023年7月5日。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国湖北武汉市武汉大学。
[0007]所述尖孢镰刀菌是从国家中药材生产(湖南)技术中心(28.18N 113.08E)采集的博落回根中分离得到的，其在平板中呈现浅紫色，菌表面产生气生菌丝为绒状，白或粉白色，随着菌丝生长，正面可见紫色菌丝团，在液体培养基中生长初期呈浅粉色，生长后期呈深紫色，在pH 5.8
‑
6.2、28
‑
30℃范围内可快速生长。
[0008]本专利技术使用了MEGA X软件按邻接法构建系统发育树，所得菌株Fusarium oxysporum MCF8与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum MJ21的序列有99.83％的同源性。
[0009]本专利技术还提供了上述尖孢镰刀菌的应用，用于生产生物碱类物质，尤其是发酵生产生物碱类物质。
[0010]所述尖孢镰刀菌发酵生产生物碱类物质的步骤如下：
[0011](1)将尖孢镰刀菌菌液加入到液体培养基中培养，获得发酵液；
[0012](2)将发酵液置于细胞破碎仪上破碎，得到菌体完全破碎开的发酵液；
[0013](3)将破碎处理后的发酵液采用有机溶剂提取、浓缩。
[0014]步骤(1)是在PDB液体培养基中培养，获得发酵液；
[0015]进一步地，步骤(1)中，按1
‑
2％的接种量将菌液加入到PDB培养基中培养7
‑
10d，培养温度为28
‑
30℃，转速为180
‑
200rpm。
[0016]步骤(2)中菌体破碎温度为25
‑
28℃，变幅杆为06，破碎总时长为1
‑
1.5h，其中每超声2s，间隙3s。
[0017]步骤(3)中，将破碎处理后的发酵液与二氯甲烷混合，静置放置后，分离得到下层有机相，备用；
[0018]将初提取后分离了下层有机相的发酵液再次与二氯甲烷混合，静置后取下层有机相，将两次提取收集到的有机相混合；
[0019]将提取收集到的有机相浓缩，得到浓缩液。
[0020]进一步地，将破碎处理后的发酵液与二氯甲烷按1：1等比例混合，摇晃使其充分接触，静置放置12h后，分离得到下层有机相；
[0021]将初提取后的发酵液与二氯甲烷按2：1的比例充分混合，静置4
‑
6h后取下层有机相；将两次提取收集到的有机相混合。
[0022]进一步地，有机相浓缩：旋蒸水温设置为35
‑
39℃，冷却塔温度设置为
‑
10℃，旋蒸前，用甲醇将蒸馏瓶充分清洗干净后再使用，旋蒸完后，依次用1mL、2mL、2mL甲醇分三次冲洗蒸馏瓶内壁，三次洗液收集得到浓缩液。
[0023]所述的尖孢镰刀菌的应用，还可以是：
[0024]将步骤(2)得到的发酵液真空冷冻干燥，研磨至粉末状；将粉末溶解到50mL70％的甲醇提取液中；每30min涡旋一次，每次持续30s，共涡旋6次，样本置于4℃过夜；12000rpm离
心10min后，吸取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤。
[0025]生物碱显色反应：制备碘
‑
碘化钾试剂(a)、硅钨酸试剂(b)和碘化铋钾试剂(c)3种显色剂，将浓度为0.1mg/mL的生物碱混标分别梯度稀释，不同浓度的生物碱混标、甲醇以及内生菌发酵液分别与显色剂发生显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产生物碱尖孢镰刀菌，分类命名为Fusarium oxysporum MCF8，保藏号为CCTCC M 20231196。2.权利要求1所述的尖孢镰刀菌的应用，其特征在于，用于生产生物碱类物质。3.根据权利要求2所述的尖孢镰刀菌的应用，其特征在于，用于发酵生产生物碱类物质。4.根据权利要求3所述的尖孢镰刀菌的应用，其特征在于，所述尖孢镰刀菌发酵生产生物碱类物质的步骤如下：(1)将尖孢镰刀菌菌液加入到液体培养基中培养，获得发酵液；(2)将发酵液置于细胞破碎仪上破碎，得到菌体完全破碎开的发酵液；(3)将破碎处理后的发酵液采用有机溶剂提取、浓缩。5.根据权利要求4所述的尖孢镰刀菌的应用，其特征在于，步骤(1)是在PDB液体培养基中培养，获得发酵液；进一步地，步骤(1)中，按1
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2％的接种量将菌液加入到PDB培养基中培养7
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10d，培养温度为28
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30℃，转速为180
‑
200rpm。6.根据权利要求4所述的尖孢镰刀菌的应用，其特征在于，步骤(2)中菌体破碎温度为25
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28℃，变幅杆为06，破碎总时长为1
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1.5h，其中每超声2s，间隙3s。7.根据权利要求4所述的尖...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：湖南麦肯伟科技有限公司，
类型：发明
国别省市：