豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法技术

本发明专利技术公开了一种豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法，包括以下步骤：（１）向豆酱中加入三氯乙酸溶液，均质，离心，收集上清液；（２）向上清液中加入正己烷，振荡，静止分层后取出下层三氯乙酸相，备用；（３）向三氯乙酸相中加入ＮａＯＨ溶液，再加入ＮａＨＣＯ３溶液缓冲，混合丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生；（４）氨水去除丹磺酰氯终止反应，得到衍生液，过滤。本发明专利技术分离方法处理过程简单，消耗试剂少，避免了转移时所造成的分析物损失。经本发明专利技术分离净化后可达到检测要求，谱图杂峰干扰少且待测物损失小，生物胺的回收率可达到８０％以上。本发明专利技术方法确定了衍生生物胺的最佳条件，丹磺酰氯衍生产物稳定，检测灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物胺的分离和衍生化方法，尤其涉及从豆酱中分离生物胺以及将生物胺液相色谱柱柱前衍生化的方法，属于生物胺的分离和检测领域。
技术介绍
豆酱中的生物胺主要是通过其中存在的微生物所产生的氨基酸脱羧酶的脱羧作 用而生成的。生物胺的产生需要3方面的条件存在生成生物胺的前体物质-游离氨基酸； 具有可使氨基酸发生脱羧反应的条件；适宜微生物生长的环境。 豆酱发酵过程中由于微生物作用生成的生物胺有组胺、腐胺、尸胺、色胺、酪胺、 e-苯乙胺、精胺和亚精胺等。生物胺中如N-亚硝胺被认为是致癌物质，目前已有关于高生 物胺含量的豆类产品的报道。韩国豆酱含盐量很高(大约12%或者更高)，很可能会导致 高血压和肾脏疾病，因此需采用低盐发酵技术，但低盐条件比高盐条件更适合于微生物的 生长，在低盐发酵过程中很可能会产生更多的生物胺。在豆酱发酵过程中采用照射技术可 以阻止微生物的生长，从而有效抑制生物胺的形成。 豆酱自然发酵过程中，涉及微生物的种类很多，豆酱中生物胺的形成与微生物有 密切关系，但并非所有种类的微生物都会产生氨基酸脱羧酶，生成生物胺。豆酱发酵过程主 要包括细菌、酵母菌、霉菌，这些微生物都有可能与生物胺的形成有关。不同微生物分解蛋 白的能力不同，一般真菌比细菌易分解蛋白质。细菌中能分解蛋白质的有变形杆菌、梭菌、 芽孢菌、假单胞菌和小球菌等，它们只有在大量繁殖时才可以形成蛋白酶。微生物产生蛋白 酶，分解蛋白质形成各种短肽，然后在肽酶作用下生成氨基酸，游离氨基酸是影响生物胺形 成的重要因素之一，它对豆酱中生物胺的形成具有重要作用。大豆的蛋白质含量较高，在豆 酱发酵过程中，随发酵时间的增加，越来越多的蛋白质被降解，游离氨基酸、肽分子的含量 随之增加，这些物质均可作为微生物所产生的脱羧酶的催化反应底物，从而生成各种生物 胺。 由于多数微生物的生长受温度影响很大，在适于微生物生长的温度时，会产生大 量生物胺。低温下产胺菌生长缓慢，导致食品中生物胺含量较低。贮存温度越高，生物胺含 量增加速度越快。由于生物胺具有潜在的毒性，因此豆酱中生物胺的生成必须引起高度重 视。 分析检测样品中的生物胺时，首先是要把生物胺从基质中提取出来。生物胺的提 取一般选用酸性介质或有机相介质。酸性介质一般有盐酸、高氯酸和三氯乙酸；有机相介 质如甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷等，还有用乙腈-高氯酸、二氯甲烷-高氯酸等混合液作为 生物胺的提取介质。肉类、水产品及植物性食品中生物胺的提取，一般采用浓度为0. 1 0. 5mol/L的盐酸、0. 4 0. 6mol/L的高氯酸或5 6%的三氯乙酸等酸性介质提取，由于在 这些样品中5%的三氯乙酸对蛋白质的沉淀效果好于盐酸，因此提取蛋白含量较高样品中 的生物胺时，三氯乙酸的使用较多。但对于奶酪中生物胺的提取一般采用0. lmol/L盐酸效 果较好。 食品基质成分比较复杂，常含有蛋白质、游离氨基酸、脂肪、糖类、多酚类化合物和 一些其他成分等。这些成分的存在会影响生物胺的有效分离和准确定性定量，同时也会降 低检测设备的灵敏度，具有堵塞色谱柱的危险。因此应用高效液相色谱法检测生物胺时，在 衍生化前还需对基质复杂的食物样品中生物胺的提取液进行净化处理。生物胺的净化方法 目前主要有两种一种是采用固相萃取(SPE)法；另一种是采用有机溶剂的液-液萃取法。 目前净化生物胺的固相萃取方法主要采用SPE C18柱和强阴离子交换(SAX)柱。spe (:18柱属于非极性柱，能够除去非极性物质。含生物胺的液体无需处理就可直接过(:18柱，多酚和非极性物质被保留在柱上，达到净化生物胺的目的。SAX柱是强阴离子交换柱，阴 离子物质可被除去，同时还可起到浓縮和脱色的作用。SAX柱的净化效果比SPE (:18柱好。 过SAX柱时样品提取液的pH是影响净化效果的关键因素，将液体食品或提取液的pH调到 8(使多酚和氨基酸呈阴离子态)，样品经过柱后，阳离子状态的生物胺保留在柱上。 液-液萃取是采用一种有机溶剂或几种混合有机溶剂萃取出样品中的生物胺，从 而达到净化的目的。这一方法虽然操作步骤较繁琐，但可以得到较高的灵敏度。液-液萃 取的基本步骤是样品提取液先用盐进行饱和处理，然后调PH至碱性，最后用有机溶剂(正 丁醇，正丁醇-氯仿)萃取。其中饱和所用盐的种类、溶液的pH和有机溶剂的选择是影响 液_液萃取效果的重要因素。盐可以促使生物胺进入有机相，但Na2C03会改变溶液的pH，所 以一般选用NaCl作为饱和用盐。pH影响部分生物胺的萃取效率，研究认为pHll. 5时生物 胺回收率最高。液-液萃取中，利用三氯乙酸提取比利用HCl提取生物胺时对pH的要求更 严格。正丁醇萃取时，组胺、酪胺的回收效果较好，但腐胺、尸胺、精胺和亚精胺的回收率较 低。正丁醇-氯仿(i : l，v/V)比正丁醇容易蒸干，但在处理奶类制品时会产生难于分离 的胶体。所以，处理乳制品时一般采用正丁醇为萃取溶剂，其他种类食品则采用正丁醇-氯 仿(1 : 1， v/v)为萃取溶剂。由于净化方法繁琐，也有研究者对液体样品(如葡萄酒)或 食品生物胺提取液仅用滤膜(0. 22 0. 45iim)处理，然后衍生化或直接进样(自动衍生)。 常用的柱前衍生剂有丹磺酰氯、邻苯二甲醛、二硝基苯甲酰氯和荧光胺等，也有研 究用9-芴基甲基-氯甲酸酯和苯基异硫氰酸盐作为生物胺的衍生剂。选择衍生剂时，要以 衍生产物稳定性好、杂质少、衍生过程简单为原则，但所有衍生试剂都有一定的局限性。二 硝基苯甲酰氯衍生物和苯基异硫氰酸盐衍生物不具备荧光特性，不能用荧光检测器检测， 只能紫外检测器进行检测，其方法灵敏度低于其他衍生试剂。9-芴基甲基-氯甲酸酯衍生 物具有荧光特性，灵敏度、稳定性都很好，但它产生从单胺到多胺的多重产物，在检测基质 复杂的样品和多种混合标准物时干扰严重；邻苯二甲醛的优点是能与初级胺在几分钟内反 应生成较强的荧光物质，因衍生所需时间短，容易实现自动化， 一般的柱前、柱后衍生均采 用邻苯二甲醛试剂；但邻苯二甲醛衍生物不稳定，衍生后不允许净化，并且对衍生条件有严 格的要求，为避免干扰，增加灵敏度，以邻苯二甲醛为衍生剂时，需加入2-巯基乙醇。丹磺 酰氯衍生反应时间较长，但产物稳定，于暗处4t:保存一个月损失不超过10%。检测灵敏度 也较高，柱前、柱后衍生均可使用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是对现有的从豆酱中分离生物胺的方法以及生物胺的液相色谱柱柱前衍生化方法的各种工艺或条件进行优化和筛选，得到一套完整的从豆酱中分离生物胺的方法以及生物胺的液相色谱柱柱前衍生化方法，该方法具有分离效率高、 衍生化效果高等优点。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 ，包括以下步骤(l)向豆酱 中加入三氯乙酸溶液，均质，离心，收集上清液；(2)向上清液中加入正己烷，振荡，静止分 层后取出下层三氯乙酸相，备用；(3)向三氯乙酸相中加入Na0H溶液，再加入NaHC03溶液 缓冲，混合丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生化反应；(4)氨水去除丹磺酰氯终止反应，得到衍生 液；衍生液过滤，即得。 优选的，步骤(1)中向豆酱中加入1.5倍豆酱质量的5%三氯乙酸溶液；所述的 均质优选为在lOOOOr/min转速本文档来自技高网...

【技术保护点】
豆酱中生物胺的分离和液相色谱柱柱前衍生化方法，包括以下步骤：（１）向豆酱中加入三氯乙酸溶液，均质，离心，收集上清液；（２）向上清液中加入正己烷，振荡，静止分层后取出下层三氯乙酸相，备用；（３）向三氯乙酸相中加入ＮａＯＨ溶液，再加入ＮａＨＣＯ↓［３］溶液缓冲，混合丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生化反应；（４）氨水去除丹磺酰氯终止反应，得到衍生液；衍生液过滤，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江连洲，韩翠萍，王鹏，程建军，魏冬旭，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]