一种小肽物质的固相萃取-液质联用检测方法技术

本发明专利技术涉及兴奋剂检测技术领域，具体而言，涉及一种小肽物质的固相萃取

【技术实现步骤摘要】
一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法


[0001]本专利技术涉及兴奋剂检测
，具体而言，涉及一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法。

技术介绍

[0002]小肽药物是指含有4
‑
16个氨基酸残基的、分子量低于2000的肽类化合物，其代谢物是指含有3个氨基酸残基以上的，分子量大于300的肽类化合物。世界反兴奋剂机构(World Aniti
‑
Doping Agency，WADA)在其禁用清单中要求对于这类药物初筛检测限和确证限分别应不高于0.5
‑
1.0ng/mL和1.0
‑
2.0ng/mL。
[0003]目前对于人尿中小肽药物及其代谢物的检测方法已有研究报道，主要的前处理方法包括原尿稀释直接进样法和固相萃取法，主要的仪器方法采用液相色谱
‑
质谱联用法进行检测。
[0004]原尿稀释进样法由于在前处理中降低了目标物质的浓度，为了提高检测灵敏度，需要在色谱流动相中加入二甲亚砜，但这样会对液相系统造成污染，影响对于小分子类化合物的检测，并且增加维护成本。
[0005]固相萃取法由于可以对尿液起到富集和净化作用，因此应用更加广泛。但目前的固相萃取法仍存在一些问题，如对于特定小肽药物或代谢物，其回收率很低，从而降低了检测的灵敏度，另外，固相萃取方法目前几乎全部采用人工处理，较为消耗人力。因此建立一种对绝大多数小肽类药物及其代谢物都具有较高回收率的固相萃取方法，并将其利用商品化的自动固相萃取装置实现显得极为必要，且目前国内外尚无小肽药物固相萃取自动化的文献和专利报道。同时，目前国内外采用的仪器检测方法大部分均为利用超高效液相色谱
‑
四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测，并采用电喷雾离子源，以全扫模式进行数据采集，该方法固然能够实现在未来回溯分析目前尚未建立检测窗口的药物，但其背景干扰较大，常用于初筛(screening)，在不使用更加高级的检测仪器时，若前处理方法仍采用原尿稀释进样，则难以用于确证(confirmation)，因此需开发合适的方法同时满足初筛和确证的要求。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法。
[0007]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，先分别对待测尿样、阴性对照尿样和阳性对照尿样进行固相萃取，再对固相萃取后的各样本分别进行超高效液相色谱
‑
四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱检测分析；对比各样本的分析结果，确定所述待测尿样中所述小肽物质的种类；
[0009]所述固相萃取的方式为全自动固相萃取，所述全自动固相萃取包括以下步骤：在
所述待测尿样中加入内标溶液和缓冲溶液，再将所述待测尿样、所述阴性对照尿样和所述阳性对照尿样分别加入一个活化后的固相萃取小柱中，采用甲酸和甲醇的混合溶液进行洗脱，并分别得到固相萃取后的各溶液；
[0010]其中，甲酸的体积百分数占所述混合溶液总体积的2
‑
10％；洗脱压力为0.5
‑
0.8bar，洗脱的持续时间为90
‑
150s。
[0011]进一步，所述内标溶液的溶质为DCVDV和GHRP
‑
4D4，溶剂为水、乙腈和甲酸的混合物；其中，DCVDV的浓度为0.15ng/μL，GHRP
‑
4D4的浓度为0.075ng/μL，溶剂中，水的体积百分数为49.5％，乙腈的体积百分数为49.5％，甲酸的体积百分数为1％。
[0012]进一步，所述缓冲液的pH值为6；加入缓冲溶液后最终的pH范围为6.0
‑
6.5。
[0013]进一步，所述阴性对照尿样为不含有所述小肽物质的空白尿样；所述阳性对照组尿样为所述小肽物质的标准品混合溶液的尿样。
[0014]进一步，所述全自动固相萃取的具体步骤为：
[0015]S1
‑
1在待测尿样中添加20μL所述内标溶液，并混合均匀；每份所述待测尿样的体积为1.8mL；
[0016]S1
‑
2、调节所述待测尿样的pH值：向所述待测尿样中加入与其体积相等的所述缓冲液，混匀并静置；
[0017]S1
‑
3、活化所述固相萃取小柱：分别向每个所述固相萃取小柱中加入甲醇溶液进行活化；所述固相萃取小柱为Waters Oasis WCX固相萃取小柱，规格为1cc、30mg；
[0018]S1
‑
4、进样：将所述待测尿样、所述阴性对照尿样和阳性对照尿样分别加入一个活化后的所述固相萃取小柱中；
[0019]S1
‑
5、淋洗：依次采用去离子水和甲醇溶液对每个所述固相萃取小柱进行淋洗；
[0020]S1
‑
6、洗脱：淋洗后进行洗脱，对每个所述固相萃取小柱进行洗脱，得到各溶液的洗脱液；
[0021]S1
‑
7、将各溶液的洗脱液吹干，再分别加入100μL体积百分数为2％的乙酸水溶液，混合均匀后得到固相萃取后的各溶液。
[0022]进一步，所述步骤S1
‑
3中，每个所述固相萃取小柱中加入的甲醇溶液体积为1mL，所述活化的正压程序为，正压压力0.6bar，持续时间为105s；然后加入1mL去离子水平衡，正压压力为0.8bar，持续时间为150s。
[0023]进一步，所述步骤S1
‑
4中，分两次向一个所述固相萃取小柱中加入静置后的所述待测尿样、所述阴性对照溶液或所述阳性对照溶液，每次加入1mL；每次加入后的正压程序为，先以0.8bar持续120s，再以1.2bar持续60s，再以2.0bar持续180s。
[0024]进一步，所述步骤S1
‑
5中，先采用1mL去离子水对每个所述固相小柱进行淋洗，再采用0.3
‑
0.7mL甲醇溶液对每个所述固相小柱进行淋洗；所述淋洗的压力为0.4
‑
0.8bar，持续时间为90
‑
150s。
[0025]进一步，所述超高效液相色谱
‑
四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱检测分析中，液相色谱的条件如下：
[0026]所述液相色谱柱为Thermo Hypersil GOLD的C
18
色谱柱，规格为100mm
×
2.1mm,填充物的粒径为1.9μm，柱温为30℃；
[0027]所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为甲酸铵
‑
甲酸缓冲
液；所述流动相B为甲醇溶液；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，先分别对待测尿样、阴性对照尿样和阳性对照尿样进行固相萃取，再对固相萃取后的各样本分别进行超高效液相色谱
‑
四极杆
‑
静电场轨道阱高分辨质谱检测分析；对比各样本的分析结果，确定所述待测尿样中小肽物质的个数和种类；所述固相萃取的方式为全自动固相萃取，所述全自动固相萃取包括以下步骤：在所述待测尿样中加入内标溶液和缓冲溶液，再将所述待测尿样、所述阴性对照尿样和所述阳性对照尿样分别加入一个活化后的固相萃取小柱中，采用甲酸和甲醇的混合溶液进行洗脱，并分别得到固相萃取后的各溶液；其中，甲酸的体积百分数占所述混合溶液总体积的2
‑
10％；洗脱压力为0.5
‑
0.8bar，洗脱的持续时间为90
‑
150s。2.根据权利要求1所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述内标溶液的溶质为DCVDV和GHRP
‑
4D4，溶剂为水、乙腈和甲酸的混合物；其中，DCVDV的浓度为0.15ng/μL，GHRP
‑
4D4的浓度为0.075ng/μL，溶剂中，水的体积百分数为49.5％，乙腈的体积百分数为49.5％，甲酸的体积百分数为1％。3.根据权利要求2所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为6；加入缓冲溶液后所述待测尿样最终的pH范围为6.0～6.5。4.根据权利要求1～3任意一项所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述阴性对照尿样为不含有所述小肽物质的空白尿液；所述阳性对照尿样为含有多种所述小肽物质的标准品混合溶液的尿样。5.根据权利要求4所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述全自动固相萃取的具体步骤为：S1
‑
1、加入内标溶液：向1.8mL的所述待测尿样中添加20μL所述内标溶液，并混合均匀；S1
‑
2、调节所述待测尿样的pH值：向所述待测尿样中加入与其体积相等的所述缓冲液，混匀并静置；S1
‑
3、活化所述固相萃取小柱：分别向每个所述固相萃取小柱中加入甲醇溶液进行活化；所述固相萃取小柱为Waters Oasis WCX固相萃取小柱，规格为1cc、30mg；S1
‑
4、进样：将所述待测尿样、所述阴性对照尿样和所述阳性对照尿样分别加入一个活化后的所述固相萃取小柱中；S1
‑
5、淋洗：依次采用去离子水和甲醇溶液对每个所述固相萃取小柱进行淋洗；S1
‑
6、洗脱：采用甲酸和甲醇的混合溶液对每个所述固相萃取小柱进行洗脱，得到各溶液的洗脱液；S1
‑
7、将各溶液的洗脱液吹干，再分别加入100μL体积百分数为2％的乙酸水溶液，混合均匀后得到固相萃取后的各溶液。6.根据权利要求5所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤S1
‑
3中，每个所述固相萃取小柱中加入的甲醇溶液体积为1mL；所述活化的正压程序为，先在正压压力0.6bar下持续105s，解除压力后，加入1mL去离子水平衡，再正压压力0.8bar下持续150s。7.根据权利要求5所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤S1
‑
4中，分两次向一个所述固相萃取小柱中加入静置后的所述待测尿样、所述阴性
对照尿样或所述阳性对照尿样，每次加入1mL；每次加入后的正压程序为，先以0.8bar持续120s，再以1.2bar持续60s，再以2.0bar持续180s。8.根据权利要求5所述一种小肽物质的固相萃取
‑
液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤S1
‑
5中，先采用1mL去离子水对每个所述固相小柱进行淋洗，再采用0.3
‑
0.7mL甲醇溶液对每个所述固相小柱进行淋洗；所述淋洗的压...

【专利技术属性】
技术研发人员：常巍，刘赟玺，马聪聪，刘福光，王占良，张力思，
申请(专利权)人：北京体育大学，
类型：发明
国别省市：