本发明专利技术公开了一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：基于目标基因PTH1Rc.1325_1336del突变位点设计gRNA；根据所述gRNA序列设计供体寡核苷酸供体DNA；将小鼠Pth1r基因的gRNA、含有c.1325_1336del突变的供体DNA和Cas9共同注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫中，获得F0代小鼠；经PCR和测序验证正确的F0代阳性杂合子小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配获得可稳定遗传的阳性F1代小鼠，F1代杂交得到F2，经基因测序验证得到Pth1r基因c.1325_1336del的原发性牙齿萌出障碍小鼠模型。本发明专利技术的动物模型为研究PTH1R基因c.1325_1336del突变人群PFE的发病机制的理想载体，弥补了现有动物模型的不足，为PFE相关的发病机制及干预研究提供了良好的基础，可以为PFE的相关研究提供更加深入的见解。加深入的见解。加深入的见解。
【技术实现步骤摘要】
一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法及应用
[0001]本专利技术涉及动物模型
，尤其涉及一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
[0002]原发性牙齿萌出障碍(Primary failure oferuption,PFE)是一种罕见的常染色体显性遗传病，发病率仅0.06％。PFE由Proffit在1981年正式提出，定义为“没有固连的牙齿因萌出机制异常导致牙齿部分或全部不能萌出，是造成开合的病因之一”。PFE患者没有系统性的全身疾病，也不存在干扰牙齿萌出的局部障碍因素。PFE的诊治困难，目前临床上缺乏治疗PFE的手段。PFE患牙对正畸力几乎无反应，受正畸力的PFE患牙不发生移动或仅倾斜移动1
‑
2mm。
[0003]大量研究已经证实，PFE与甲状旁腺激素受体1基因(parathyroid hormone receptor 1，PTH1R)突变有关。PTH1R基因位于人的第3号常染色体短臂上(3p22
‑
21.1)，在人体的肾脏、肺、口腔等多个器官中均有表达。其编码的是甲状旁腺激素受体1(PTHR1)或称PPR，一种B类G蛋白偶联受体。PTH1R基因通过调控牙骨质及牙周膜附着组织的形成影响牙根形成及牙齿萌出，是牙齿发育及萌出中的关键因素。PTH1R基因c.1325_1336del突变位点在一个PFE家系中首次被发现，父子三人均携带这一突变位点，证实其发生稳定遗传。该位点的致病性明确，但致病机制未明。采用基因工程技术构建模拟人类PTH1R基因c.1325_1336del突变位点的动物模型有望成为解决PFE相关科学问题的关键。
[0004]已有国内外研究通过建立PTH1R基因点突变的细胞模型来研究PFE的发病机制。现有细胞模型有：Cos7细胞(1092delG PTH1R)、Hela细胞(356C>T、395C>T、439C>T和1148G>A)、非洲爪蟾卵母细胞(PTH1R/Trp339stop)。这些细胞模型虽然模拟了PTH1R基因的点突变，但不足之处在于：实验所采用的肾源性细胞或Hela细胞与牙齿发育的相关性较弱，与牙源性细胞相比同质性差别较大，不能准确反映PTH1R基因点突变在牙齿发育过程中所发挥的作用，以此来研究PFE的发病机制存在明显的局限性。
[0005]现有关于PTH1R基因突变的动物模型有：通过Prx1启动子条件性缺失Pth1r构建的PFE小鼠模型；将表达PTHrP牙囊细胞中的Pth1r双等位基因失活后建立的PFE小鼠模型；选择性敲除表达Osx基因细胞中的Pth1r获得的PFE小鼠模型。这些动物模型多采用条件性敲除技术，不足之处在于：1、条件性敲除小鼠敲除的是全长PTH1R基因，而PFE患者多为PTH1R基因的某个片段异常；2、PFE患者为全身的PTH1R基因发生异常，而条件性敲除小鼠为局部组织中的Pth1r基因缺失，不能反映基因突变对其他器官造成的影响。因此，条件性敲除获得的小鼠在用于研究临床PFE患者的发病机制时存在明显缺陷。
[0006]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有关于PTH1R基因突变的动物模型从分子遗传学层面不能准确模拟临床PFE患者发病的病理过程。由于PFE的发病机制尚不清楚，缺乏有效的诊治手段，亟需一种能够模拟人PFE发病的动物模型。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的是提出一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法及应用，从而更准确的模拟人类PTH1R基因突变后导致PFE的过程。
[0008]本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现：
[0009]本专利技术的目的之一在于提供一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0010](1)基于目标基因PTH1R c.1325_1336del突变位点设计gRNA；
[0011](2)根据所述gRNA序列设计供体寡核苷酸供体DNA；
[0012](3)将小鼠Pth1r基因的gRNA、含有c.1325_1336del突变的供体DNA和Cas9共同注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫中，获得F0代小鼠；
[0013](4)经PCR和测序验证，将所述F0代小鼠划分为野生型小鼠或阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配获得可稳定遗传的阳性F1代小鼠；
[0014](5)将所述F1代小鼠杂交得到F2代小鼠，通过基因鉴定可获得3种Pth1r基因型：Pth1r野生型、Pth1r突变杂合子、Pth1r突变纯合子。
[0015]进一步的，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.1所示：
[0016]gRNA
‑
A1:AGAGCATCTCATAGTGCATC
‑
TGG；
[0017]所述供体DNA的序列如SEQ ID NO.2所示：
[0018]Oligo:
[0019]CCGTCTTCATGGCCTTGCCGTACACCGAGGTCTCAGGGACACT GTGGCAGATCCAGATGCTCTTCAACTCCTTCCAGGTGTGCGGCCTG CCTGGGGTTCTGGGGAGTGCACGGGGTGGGGC。
[0020]进一步的，所述gRNA、供体DNA和Cas9的混合物中，gRNA的浓度为2pmol/μl，供体DNA的浓度为100ng/μl，Cas9的浓度为30ng/μl。
[0021]进一步的，所述基因型鉴定或筛选步骤中，繁育的小鼠出生后1
‑
2周剪尾并提取基因组DNA，通过PCR反应，将得到的PCR产物进行测序、基因型鉴定或筛选；将PCR扩增产物进行测序，得到小鼠的基因型。
[0022]进一步的，所述提取基因组DNA过程中使用TaKaRa MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒(Ver.5.0_Code No.9765)获得高纯度的基因组DNA。
[0023]进一步的，所述PCR反应引物为：
[0024]正向引物(F1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5'
‑
AGGAGAAGCGACTGTTGTGAGG
‑
3'；
[0025]反向引物(R1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5'
‑
CCATTGCAGAAAGTATATGATG
‑
3'。
[0026]进一步的，所述PCR反应所使用的Taq DNA聚合酶是GreenTaqMix(Vazyme P131)。
[0027]本专利技术的目的之二在于上述的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法构建得到的动物模型在制备研究原发性牙齿萌出障碍疾病的产品中的用途。
[0028]本专利技术的目的之三在于上述的PTH1R基因点突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)基于目标基因PTH1R c.1325_1336del突变位点设计gRNA；(2)根据所述gRNA序列设计供体寡核苷酸供体DNA；(3)将小鼠Pth1r基因的gRNA、含有c.1325_1336del突变的供体DNA和Cas9共同注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫中，获得F0代小鼠；(4)经PCR和测序验证，将所述F0代小鼠划分为野生型小鼠或阳性杂合子小鼠，然后将所述阳性杂合子小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配获得可稳定遗传的阳性F1代小鼠；(5)将所述F1代小鼠杂交得到F2代小鼠，通过基因鉴定可获得3种Pth1r基因型：Pth1r野生型、Pth1r突变杂合子、Pth1r突变纯合子。2.根据权利要求1所述的一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述gRNA的序列如SEQ ID NO.1所示：gRNA
‑
A1:AGAGCATCTCATAGTGCATC
‑
TGG；所述供体DNA的序列如SEQ ID NO.2所示：Oligo:CCGTCTTCATGGCCTTGCCGTACACCGAGGTCTCAGGGACAC TGTGGCAGATCCAGATGCTCTTCAACTCCTTCCAGGTGTGCGGCC TGCCTGGGGTTCTGGGGAGTGCACGGGGTGGGGC。3.根据权利要求1所述的一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述gRNA、供体DNA和Cas9的混合物中，gRNA的浓度为2pmol/μl，供体DNA的浓度为100ng/μl，Cas9的浓度为30ng/μl。4.根据权利要求1所述的一种原发性牙齿萌出障碍的PTH1R基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述基因型鉴定或筛选步骤中，繁育的小鼠出生后1...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔卫东，查蕴宸，李舒舒，孔德明，
申请(专利权)人：暨南大学附属第一医院广州华侨医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。