蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法、培养基及培养基制备方法技术

本发明专利技术公开了蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法，包括酒精棉球的制备、蜚蠊目昆虫卵鞘的擦拭、蜚蠊目昆虫胚胎取出、蜚蠊目昆虫细胞悬液的制备、培养和蜚蠊目昆虫细胞系的建立步骤，同时公开了用于蜚蠊目昆虫细胞原代培养的培养基，包括水、Grace培养基、海藻糖、酵母抽提物和胎牛血清。本发明专利技术的培养方法获取的组织悬液在后期的培养中组织细胞的离散及分化程度更高，该发明专利技术的方法降低了原代培养的污染率且获得了分化率较高的组织，极大的提高了蜚蠊目昆虫细胞原代培养的成功率。虫细胞原代培养的成功率。

【技术实现步骤摘要】
蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法、培养基及培养基制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法、培养基及培养基制备方法。

技术介绍

[0002]蜚蠊目昆虫多生长在脏乱差的环境中，由于成虫表面带有较多种类的微生物，进行成虫原代培养时特别容易消毒不彻底而污染，造成原代培养不成功。其次，蜚蠊目昆虫若虫及成虫体内脂肪体含量较高，进行各组织细胞的原代培养时容易带入大量脂肪体细胞形成油脂层漂浮在培养基中，影响原代细胞生长，这是蜚蠊目昆虫细胞培养较为困难的两个主要原因(如图1所示)。
[0003]目前针对昆虫细胞培养，一般为选取胚胎、新孵幼虫；成虫的精巢、卵巢、脂肪体、血淋巴等组织。且挑取组织后都进行组织的清洗、消化及剪碎后进行原代培养。对于蜚蠊目昆虫来说，由于其卵鞘多产于粪便等脏乱环境中，被大量污秽物质包裹，一般没有选做原代培养材料，主要选取成虫的精巢、卵巢为原代培养材料，挑取组织后进行PBS液清洗、胰酶消化及剪碎后进行原代培养，此技术污染率较高且细胞生长状态较差，原代培养不易培养至传代培养。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法，本方法选用临近孵化期的蜚蠊目昆虫卵鞘，对卵鞘进行酒精棉球擦拭消毒处理，消毒后直接捏开卵鞘，用眼科镊轻撕开胚胎膜顶部后取出胚胎进行研磨后直接进行培养，通过本方法获取的组织悬液在后期的培养中组织细胞的离散及分化程度更高，该专利技术的方法降低了原代培养的污染率且获得了分化率较高的组织，极大的提高了蜚蠊目昆虫细胞原代培养的成功率。
[0005]为了达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现的：
[0006]蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法，包括以下步骤：
[0007]S1、酒精棉球的制备：用质量浓度为65～80％的酒精溶液浸泡棉球1
‑
3d，制成酒精棉球；
[0008]S2、蜚蠊目昆虫卵鞘的擦拭：取步骤S1的酒精棉球擦拭距孵化期3
‑
10d的蜚蠊目昆虫卵鞘，直至卵鞘表面光滑清洁；
[0009]S3、蜚蠊目昆虫胚胎取出：手指轻捏步骤S2的蜚蠊目昆虫卵鞘，卵荚缝朝上，捏至卵鞘从卵荚缝列开，可见两排整齐由胚胎膜包裹的胚胎，用眼科镊轻撕开胚胎膜顶部后取出胚胎；
[0010]S4、蜚蠊目昆虫细胞悬液的制备：将步骤S3取出的胚胎转入质量浓度为0.10
‑
0.25％的胰酶溶液中，在1.5
‑
2ml离心管中将胚胎研末至0.5
‑
1mm3大小，消化处理5
‑
10min，得蜚蠊目昆虫细胞悬液；
[0011]S5、培养：将步骤S4获得的蜚蠊目昆虫细胞悬液吸入12.5
‑
25cm2的培养瓶中，每瓶
装入量为0.5
‑
1ml，用改良培养基补足至4
‑
5ml，将装有细胞悬液及改良培养基的培养瓶，置于25
‑
28℃的培养箱中，密闭无光照培养至细胞增殖并生长至铺满甁底；
[0012]S6、蜚蠊目昆虫细胞系的建立：将步骤5的铺满甁底的细胞进行常规悬浮并混匀后，以2:1或3:1的比例分瓶，并加入新鲜改良培养基补充至4
‑
5ml，继续在密闭无光照培养条件下培养至细胞增殖，如此传代培养至50代，使昆虫细胞系建系成功。
[0013]进一步的，在所述步骤S5中，密闭无光照培养至细胞增殖并生长至铺满甁底期间，根据细胞的生长状况进行常规换液，其中：对于贴壁的细胞，换液时，用新鲜的改良培养基直接换掉一半的原培养基；而对于悬浮的细胞，离心去掉一半上清液后，加入一半新鲜的改良培养基。
[0014]同时，本专利技术还公开了用于蜚蠊目昆虫细胞原代培养的培养基，所述培养基包括以下组分：
[0015][0016][0017]上述培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0018]将Grace培养基干粉40～50克溶解在900ml纯净水中；依次加入0.5～3g市售的海藻糖Glucose及0.5～3g市售的酵母抽提物TC
‑
Yeastolate；用1N的NaOH或1N的HCl调节pH值至6.1
‑
6.3；加入纯净水补足1000ml，按常规过滤、灭菌，加入150
‑
250ml市售的胎牛血清，得改良培养基。
[0019]本专利技术的有益效果如下：
[0020]本方法选用临近孵化期的蜚蠊目昆虫卵鞘，对卵鞘进行酒精棉球擦拭消毒处理，消毒后直接捏开卵鞘，用眼科镊轻撕开胚胎膜顶部后取出胚胎进行研磨后直接进行培养，通过本方法获取的组织悬液在后期的培养中组织细胞的离散及分化程度更高，该专利技术的方法降低了原代培养的污染率且获得了分化率较高的组织，极大的提高了蜚蠊目昆虫细胞原代培养的成功率。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1是蜚蠊目昆虫细胞培养实际培养过程中存在问题的图片；其中，图1a为蜚蠊目昆虫细胞原代培养过程中消毒不彻底而携带微生物造成污染的图片，图1b为蜚蠊目昆虫细胞原代培养时带入大量脂肪体细胞形成油脂层漂浮在培养基中的图片。
[0023]图2是采用本专利技术的方法所培养得到的蜚蠊目昆虫细胞系图片。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法，包括以下步骤：
[0026]S1、酒精棉球的制备：用质量浓度为65～80％的酒精溶液浸泡棉球1
‑
3d，制成酒精棉球；
[0027]S2、蜚蠊目昆虫卵鞘的擦拭：取步骤S1的酒精棉球擦拭距孵化期3
‑
10d的蜚蠊目昆虫卵鞘，直至卵鞘表面光滑清洁；
[0028]S3、蜚蠊目昆虫胚胎取出：手指轻捏步骤S2的蜚蠊目昆虫卵鞘，卵荚缝朝上，捏至卵鞘从卵荚缝列开，可见两排整齐由胚胎膜包裹的胚胎，用眼科镊轻撕开胚胎膜顶部后取出胚胎；
[0029]S4、蜚蠊目昆虫细胞悬液的制备：将步骤S3取出的胚胎转入质量浓度为0.10
‑
0.25％的胰酶溶液中，将研磨棒插入离心管中并在1.5
‑
2ml离心管中将胚胎研末至0.5
‑
1mm3大小，消化处理5
‑
10min，得蜚蠊目昆虫细胞悬液；
[0030]S5、培养：将步骤S4获得的蜚蠊目昆虫细胞悬液吸入12.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蜚蠊目昆虫细胞原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、酒精棉球的制备：用质量浓度为65～80％的酒精溶液浸泡棉球1
‑
3d，制成酒精棉球；S2、蜚蠊目昆虫卵鞘的擦拭：取步骤S1的酒精棉球擦拭距孵化期3
‑
10d的蜚蠊目昆虫卵鞘，直至卵鞘表面光滑清洁；S3、蜚蠊目昆虫胚胎取出：手指轻捏步骤S2的蜚蠊目昆虫卵鞘，卵荚缝朝上，捏至卵鞘从卵荚缝列开，可见两排整齐由胚胎膜包裹的胚胎，用眼科镊轻撕开胚胎膜顶部后取出胚胎；S4、蜚蠊目昆虫细胞悬液的制备：将步骤S3取出的胚胎转入质量浓度为0.10
‑
0.25％的胰酶溶液中，在1.5
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2ml离心管中将胚胎研末至0.5
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1mm3大小，消化处理5
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10min，得蜚蠊目昆虫细胞悬液；S5、培养：将步骤S4获得的蜚蠊目昆虫细胞悬液吸入12.5
‑
25cm2的培养瓶中，每瓶装入量为0.5
‑
1ml，用改良培养基补足至4
‑
5ml，将装有细胞悬液及改良培养基的培养瓶，置于25
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28℃的培养箱中，密闭无光照培养至细胞增殖并生长至铺满...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，马琛婧，李娴，丁伟峰，陈航，冯颖，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院高原林业研究所，
类型：发明
国别省市：