一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括：(1)分别装有捕获磁珠混合液、检测荧光纳米颗粒混合液、实验缓冲液、洗涤缓冲液的多个密封试剂瓶；(2)分隔并集中包装所述多个密封试剂瓶的试剂盒；(3)待测物浓度检测模块，通过数字算法与模拟算法相结合，定量检测样本中的待测物浓度。该试剂盒利用常规的流式细胞仪或其它可以检测流式荧光信号的仪器对流式荧光信号进行检测，即可进行待测物的超高灵敏定量检测，操作简便，试剂成本低。试剂成本低。试剂成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种阿尔茨海默症检测试剂盒。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)是老年痴呆症一种常见形式，目前尚无有效疗法。该病患不仅患者自身痛苦，而且对于其家庭乃至整个社会都会造成较消极的影响。迄今为止，AD发病的确切机理尚未完全清楚。
[0003]目前AD诊断检测标记物主要以脑脊液中Aβ1
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42/Aβ1
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40比值和磷酸化tau
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181浓度为主，脑脊液取样需要穿刺大脑，对病人往往产生较大的痛苦。最近AD标记物的血液检测进行了研究，中国阿尔兹海默病痴呆诊疗指南(2020年版)中也明确提到了血液中的Aβ1
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42/Aβ1
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40比值和磷酸化tau
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181浓度可以作为AD检查的指标。
[0004]然而Aβ1
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42和磷酸化tau181在血液中的浓度低，需要达到飞克/毫升级别才能满足检测需求，现有流式细胞仪免疫检测最低灵敏度通常在1
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10pg/mL,难以满足临床检测需求。传统免疫检测方法学如灵敏度最高的化学发光发均难以实现稳定检测。运用数字化免疫检测计数的单分子免疫检测方法学比传统化学发光法灵敏度高1000倍，使得运用单分子免疫检测方法检测AD血液标志物检测的首选。
[0005]数字化检测在免疫检测领域也叫单分子检测，数字化检测原理为：当检测低浓度样品时，较少的抗原随机被较多的磁珠捕获。大部分磁珠未捕获到抗原或捕获到1个抗原，小部分磁珠捕获到2个或多个抗原。一般而言，捕获到特定个数抗原的磁珠所占比例符合泊松分布理论。数字检测虽然检测灵敏度很高，但是动态范围比较窄，当样品浓度较高时，阳性磁珠所占比例会接近100％，测量误差也会增大。
[0006]数字酶联免疫法是目前常见数字化检测方法，已获湖南省药品监督管理局批准的用于血清、血浆中人磷酸化Tau
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181蛋白(pTau
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181)检测试剂盒和人β淀粉样蛋白1
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42(Aβ1
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42)检测试剂盒，试剂盒最低检测限分别为0.41pg/mL与0.75pg/mL(参见彩科生物网站colortechbio.com及国家药品监督管理局网站nmpa.gov.cn),数字化免疫检测方法大大提升了体外诊断的检测下限。该方法需要搭配专用生物芯片阅读仪和生物芯片耗材，检测步骤繁琐，检测成本昂贵，在临床应用方面存在诸多不便。
[0007]此外，免疫单分子检测领域已有的设备和文献采用了多种技术路线，大致可以分为CCD拍照、流式检测等。
[0008]其中，CCD拍照技术一种是在专用单分子检测仪器中完成，即利用磁珠孵育与酶标等免疫反应完成后将磁珠落在特定的芯片孔中进行油封，磁珠上的酶催化底物生成荧光信号被CCD相机采集成像。明场图像用于分析磁珠数目及位置，荧光照片用于分析磁珠中带有荧光标记的比例。但该方法：1)需要专用设备与耗材，检测费用高昂；2)酶促催化底物反应迅速，磁珠落孔过程和油封过程均能造成孔间荧光本底差异大，再加上CCD拍照方式分辨率低，造成低值和高值均会产生很大的检测误差；3)为了控制加底物和落孔前几乎没有游离酶分子的干扰，免疫反应需要清洗5
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6次，步骤繁琐。另一种是利用AST
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Sc单分子检测仪，即
将完成免疫反应后的磁珠在流通池中磁吸平铺，CCD相机对磁珠进行明场拍照和荧光拍照。明场图像用于分析磁珠数目及位置，荧光照片用于分析磁珠中带有荧光标记的比例，如中国专利CN114778856B，但该方式的不足在于：1)磁珠在流通池内容易堆积，CCD拍照方式分辨率低，需要磁珠上标记的单个荧光物质很亮才能有效识别，因此降低了识别率；2)在检测池内进行磁分离清洗，需要频繁维护流通池减小样本间携带污染；3)磁珠检测比例低，往往难以超过总反应数的10％，随机性大。
[0009]流式检测技术一种是采用激光共聚焦检测方式，即在磁珠完成免疫反应后，其表面结合的荧光物质被洗脱下来进入检测池，激光共聚焦光斑对检测池进行检测，分析其中荧光分子数目。但该方法：1)无法对磁珠进行计数，随机性大；2)荧光物质洗脱过程对荧光分子的构象产生变化造成荧光量子效率损伤，灵敏度不足；3)免疫反应步骤繁琐检测周期长。另一种则是采用的是非牛顿流体聚焦单光子荧光计数方式，磁珠与不同浓度的标准样品完成免疫反应，之后在非牛顿溶液中重悬，重悬后的磁珠通入毛细管，在毛细管内的流体流动中，磁珠聚焦在毛细管的中心轴线，光源发出的检测光照射毛细管内依次通过的每个磁珠，获得与每个磁珠对应的前散射光信号和荧光信号，再根据前散射信号获得磁珠数量，根据荧光信号获得与磁珠对应的荧光强度Ai，i＝1,2
···
N；根据各个标准样品的磁珠荧光强度分布，做单峰高斯拟合，得到峰中心位置；最后根据各个标准样品的浓度及峰中心位置建立峰中心位置与样品浓度的对应关系。但该方法：1)毛细管使用较高粘度的非牛顿流体非常容易造成毛细管堵塞；2)单光子计数器对于大量光子的计数统计存在瓶颈，相比PMT检测器检测动态范围相对较窄。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒及其应用，该试剂盒基于流式荧光法采用流式细胞仪或其它可以检测流式荧光信号的仪器即可进行生物标志物超高灵敏定量检测，操作简便，试剂成本低。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒，包括：
[0013](1)分别装有捕获磁珠混合液、检测荧光纳米颗粒混合液、实验缓冲液、洗涤缓冲液的多个密封试剂瓶；
[0014]所述捕获磁珠混合液中含有特异性捕获磁珠，所述特异性捕获磁珠是表面分别包被Aβ1
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42、Aβ1
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40和p
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Tau
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181捕获抗体的磁珠；
[0015]所述检测荧光纳米颗粒混合液中含有异性荧光纳米颗粒，所述特异性荧光纳米颗粒是表面分别包被Human APP/Protease Nexin II和Purified anti
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Tau,6
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18Antibody的检测抗体的荧光纳米颗粒；
[0016]捕获抗体与检测抗体分别识别蛋白的不同位点互为配对；
[0017](2)分隔并集中包装所述多个密封试剂瓶的试剂盒；
[0018](3)待测物浓度检测模块，通过数字算法与模拟算法结合定量检测样本中的待测物浓度。
[0019]优选的，所述特异性捕获磁珠是大小均匀的磁性微球，对捕获磁珠使用不同的荧光染料进行染色并编号，能够获得不同编码的捕获磁珠；对包裹有不同荧光染料的荧光纳
米颗粒并编号，能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)分别装有捕获磁珠混合液、检测荧光纳米颗粒混合液、实验缓冲液、洗涤缓冲液的多个密封试剂瓶；所述捕获磁珠混合液中含有特异性捕获磁珠，所述特异性捕获磁珠是表面分别包被Aβ1
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42、Aβ1
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40和p
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Tau
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181捕获抗体的磁珠；所述检测荧光纳米颗粒混合液中含有特异性荧光纳米颗粒，所述特异性荧光纳米颗粒是表面分别包被Human APP/Protease NexinII和Purified anti
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Tau,6
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18Antibody的检测抗体的荧光纳米颗粒；捕获抗体与检测抗体分别识别蛋白的不同位点互为配对；(2)分隔并集中包装所述多个密封试剂瓶的试剂盒；(3)待测物浓度检测模块，通过数字算法与模拟算法结合定量检测样本中的待测物浓度。2.根据权利要求1所述的基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒，其特征在于：所述特异性捕获磁珠是大小均匀的磁性微球，对捕获磁珠使用不同的荧光染料进行染色并编号，能够获得不同编码的捕获磁珠；对包裹有不同荧光染料的荧光纳米颗粒并编号，能够获得不同编码的检测荧光纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒，其特征在于：所述特异性捕获磁珠是由能分别特异性识别Aβ1
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42抗体、Aβ1
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40和p
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Tau
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181的捕获抗体，通过化学偶联包被到磁珠颗粒上制备获得；所述特异性荧光纳米颗粒是由能分别特异性识别Human APP/Protease NexinII和Purified anti
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Tau,6
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18Antibody的检测抗体通过化学偶联包被到荧光纳米颗粒上制备获得。4.根据权利要求1所述的基于流式荧光法的阿尔茨海默症检测试剂盒，其特征在于：所述特异性捕获磁珠的直径为0.6um
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6um，工作浓度为200,000个/mL～10,000,0...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖鸳鸯，仲月，李东，
申请(专利权)人：无锡博奥玛雅医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：