本实用新型专利技术公开了一种单分子检测免疫分析仪光学系统，涉及单分子检测免疫分析仪的光学系统领域。在主要和昂贵的物料如激光器和单光子探测器的使用数量不增加的情况下，通过2个分光镜和1个衰减片将激光束分成强度相等的3束，分别从3个方向照射待测物，同时进行荧光的收集。所述光学系统包括用于产生激光的激光光路、用于收集前向散射光的前向散射光检测通道以及用于收集荧光的荧光检测通道；所述激光光路包括激光器、分光镜A、分光镜B以及衰减片；三个荧光检测通道的末端连接同一个光纤向外输出荧光信号；所述前向散射光检测通道与激光束A、激光束B或激光束C三者中的一个沿流动池对称设置。实现了阳性磁珠识别率提升的效果。实现了阳性磁珠识别率提升的效果。实现了阳性磁珠识别率提升的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种单分子检测免疫分析仪光学系统
[0001]本技术涉及单分子检测免疫分析仪的光学系统领域。
技术介绍
[0002]单分子检测，其检测灵敏度可达fg级别，是传统ELISA的1000倍。
[0003]检测的生物学原理是经典的免疫反应
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双抗夹心法，磁珠上包被超过10*5数量级捕获抗体，捕获抗体捕获待测样本中的抗原，然后与加入的荧光染料标记的检测抗体形成双抗夹心结构，即结合相。因磁珠具有磁性，所以可以方便的利用磁分离的方式将上清液中的杂质去掉。
[0004]利用流式细胞术鞘流聚焦的方法进行检测是常用的检测方法之一，检测磁珠的前向散射光信号和抗体上标记的荧光染料被激光激发产生的荧光信号。磁珠的前向散射光信号用来计数，荧光信号用来判定磁珠是否形成了双抗夹心的结合相，形成双抗夹心的结合相即为阳性磁珠，否则为阴性磁珠。
[0005]待测样本中的抗原浓度为fg级别时，只有不超过5%的磁珠能捕获到抗原，形成双抗夹心的结合相。利用泊松分布理论计算出阳性磁珠对应的抗原蛋白浓度值，实现数字化fg级别的超高灵敏度检测。
[0006]待测样本中的抗原浓度较高时，大部分的磁珠都能捕获到抗原形成双抗夹心的结合相。此时荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，从而能建立标准曲线。通过对一定数量的磁珠进行检测，可以对待测抗原浓度进行定量测量。
[0007]利用专门开发的磁珠试剂系统，在现有的流式细胞仪或流式荧光分析仪上进行检测，其检测灵敏度也有望达到fg级别。如ConnieWu，TylerJ.Dougan，和DavidR. Walt等人发表的名称为“High
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Throughput, High
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Multiplex DigitalProtein Detection with Attomolar Sensitivity”的文章，在贝克曼库尔特公司生产的型号为CytoFlexLX流式细胞仪上进行检测，灵敏度达到了fg级别，实现了单分子级别的检测灵敏度。
[0008]但是流式细胞仪或流式荧光分析仪的光学系统，其激光的方向与荧光收集的方向一般是垂直的，几乎所有的流式细胞仪光学系统都是这样设计的。原因为流式细胞仪或流式荧光分析仪一般需要多个荧光通道，物镜的数值孔径（NA）也要求比较大，数值孔径达到1.2是比较理想的值。待测物以细胞为主，细胞的表面抗原数量很多，大部分细胞也有一定的透光性，所以流式细胞仪的激光方向与荧光收集方向垂直是有利于光学系统设计的，而如果是其它方式如平行的话则难度会非常大，多激光流式细胞仪的难度还会再提升一个级别。
[0009]这样的光学系统在检测磁珠时有如下的缺点：因目前所用的磁珠基本不透光，低浓度时每个磁珠上大概率只会形成一个双抗夹心的结合相，极低的概率可以形成2个，检测抗体上标记的荧光染料被激光照射到的概率为50%，产生的荧光被物镜收集到的概率也为50%，综合下来只有25%的概率会被判定为阳性磁珠（既被激光照射到，同时又被物镜收集到）。其它情形则不能保证一定会被识别为阳性磁珠。
[0010]高浓度时（比fg级别高1
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2个数量级），每个磁珠上大概率至少形成一个双抗夹心的结合相，可能存在多个，但数量不会太多。此时建立标准曲线的依据是荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，结合相多，则荧光强度应该越大，但传统流式细胞仪的光学系统还是不能保证激光能荧光强度的均一性。磁珠表面双抗夹心的结合相数量越多，均一性越好。
[0011]这样就导致最终检测结果的变异系数（CV）是比较大的，不管是低浓度时还是高浓度时均是如此。因此，如何优化现有设备，实现更加全面、更加准确的检测就成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
[0012]本技术针对以上问题，提出了一种单分子检测免疫分析仪光学系统，在主要和昂贵的物料如激光器和单光子探测器的使用数量不增加的情况下（数量均为1个），通过2个分光镜和1个衰减片将激光束分成强度相等的3束，分别从3个方向照射待测物（即磁珠），同时进行荧光的收集。
[0013]本技术的技术方案为：所述光学系统包括用于产生激光的激光光路、用于收集前向散射光的前向散射光检测通道以及用于收集荧光的荧光检测通道；
[0014]所述激光光路包括激光器100、分光镜A211、分光镜B212以及衰减片220，所述分光镜A211和分光镜B212依次固定安装在激光器100的一侧，先通过分光镜A211将激光器100发出的激光一分为二，再通过分光镜B212将经过的激光再次一分为二，使得激光器100发出的激光经过分光镜A211和分光镜B212后形成激光束A、激光束B，而经过分光镜A211分出的激光则形成激光束C，所述衰减片220固定设置在激光束C的路径上；
[0015]在激光束A的路径上固定设置用于透射激光的二向色滤光片A231，在激光束B的路径上固定设置激光反射镜B202以及用于反射激光的二向色滤光片B232，在激光束C的路径上固定设置激光反射镜C203以及用于反射激光的二向色滤光片C233，从而使得激光束A、激光束B、激光束C可以从三个不同的方向照射流动池300；
[0016]所述二向色滤光片A231透射激光的同时反射荧光，所述二向色滤光片B232、二向色滤光片C233反射激光的同时透射荧光，所述荧光检测通道具有三个，三个荧光检测通道分别接收二向色滤光片A231反射或二向色滤光片B232、二向色滤光片C233透射的荧光，并且三个荧光检测通道的末端连接同一个光纤向外输出荧光信号；
[0017]所述前向散射光检测通道与激光束A、激光束B或激光束C三者中的一个沿流动池300对称设置。
[0018]其中，在所述二向色滤光片A231和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜A241；
[0019]在所述二向色滤光片B232和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜B242；
[0020]在所述二向色滤光片C233和流动池300之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜C243。
[0021]进一步的，所述前向散射光检测通道与激光束A经消色差透镜A241聚焦的激光束沿流动池300对称设置；
[0022]所述激光束B、激光束C经过反射后从两个不同的方向照射流动池300，并且消色差
透镜B242和消色差透镜C243之间具有夹角，从而使得激光束B、激光束C分别经过消色差透镜B242、消色差透镜C243之后的中心光束之间具有夹角，从而使得经激光束C的逆向光路不能最终到达激光器内部，同时激光束C经流动池300后，经激光束B的逆向光路也不能最终到达激光器内部。
[0023]进一步的，所述激光束A、激光束B、激光束C聚焦后照射在流动池300的束腰位置重合或在三个束腰位置之间留有间距。
[0024]关于荧光检测通道；
[0025]三个所述荧光检测通道分别为设在二向色滤光片A231一侧的荧光检测通道A本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种单分子检测免疫分析仪光学系统，其特征在于，所述光学系统包括用于产生激光的激光光路、用于收集前向散射光的前向散射光检测通道以及用于收集荧光的荧光检测通道；所述激光光路包括激光器（100）、分光镜A（211）、分光镜B（212）以及衰减片（220），所述分光镜A（211）和分光镜B（212）依次固定安装在激光器（100）的一侧，先通过分光镜A（211）将激光器（100）发出的激光一分为二，再通过分光镜B（212）将经过的激光再次一分为二，使得激光器（100）发出的激光经过分光镜A（211）和分光镜B（212）后形成激光束A、激光束B，而经过分光镜A（211）分出的激光则形成激光束C，所述衰减片（220）固定设置在激光束C的路径上；在激光束A的路径上固定设置用于透射激光的二向色滤光片A（231），在激光束B的路径上固定设置激光反射镜B（202）以及用于反射激光的二向色滤光片B（232），在激光束C的路径上固定设置激光反射镜C（203）以及用于反射激光的二向色滤光片C（233）；所述二向色滤光片A（231）透射激光的同时反射荧光，所述二向色滤光片B（232）、二向色滤光片C（233）反射激光的同时透射荧光，所述荧光检测通道具有三个，三个荧光检测通道分别接收二向色滤光片A（231）反射或二向色滤光片B（232）、二向色滤光片C（233）透射的荧光，并且三个荧光检测通道的末端连接同一个光纤向外输出荧光信号；所述前向散射光检测通道与激光束A、激光束B或激光束C三者中的一个沿流动池（300）对称设置。2.根据权利要求1所述的一种单分子检测免疫分析仪光学系统，其特征在于，在所述二向色滤光片A（231）和流动池（300）之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜A（241）；在所述二向色滤光片B（232）和流动池（300）之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜B（242）；在所述二向色滤光片C（233）和流动池（300）之间设有用于聚焦激光束、收集荧光的消色差透镜C（243）。3.根据权利要求2所述的一种单分子检测免疫分析仪光学系统，其特征在于，所述前向散射光检测通道与激光束A经消色差透镜A（241）聚焦的激光束沿流动池（300）对称设置；所述激光束B、激光束C经过反射后从两个不同的方向照射流动池（300），并且消色差透镜B（242）和消色差透镜C（243）之间具有夹角，从而使得激光束B、激光束C分别经过消色差透镜B（242）...
【专利技术属性】
技术研发人员：马赛，张帅，干作飞，李东，
申请(专利权)人：无锡博奥玛雅医学科技有限公司，
类型：新型
国别省市：
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