一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，属于细胞检测技术领域，包括如下步骤：木质部细胞原生质体制备及AnnexinV、PI染色处理；对染色的木质部细胞原生质体进行成像流式检测处理；对染色的木质部细胞原生质体进行流式分群、分选；对分选后不同凋亡亚群细胞显微成像检测其形态；提取分选后不同凋亡亚群细胞的RNA，利用RT

【技术实现步骤摘要】
一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法


[0001]本专利技术涉及基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，属于细胞检测


技术介绍

[0002]木材是重要的可再生资源，也是建筑、家具生产以及造纸业的原材料。森林不仅是水库、钱库、粮库，还是碳库，对国家生态安全具有基础性、战略性作用。木材是木本植物维管形成层分化产生的次生木质部连年沉积、附加的结果。次生木质部的发育是一个连续的发育过程，包括维管形成层细胞的增殖，木质部细胞的分化和扩张，次生细胞壁的沉积和细胞程序性死亡(PCD)。最终成熟的木质部包括木质部薄壁细胞、木质纤维、导管和管状分子。
[0003]细胞程序性死亡是细胞在特定生理或病理条件下，为了维持内环境稳定，更好地适应生存环境而采取的一种由基因调控的细胞自主性死亡的生物学现象。细胞程序性死亡现象在植物生长发育过程中广泛存在，如在糊粉层发育中细胞退化胚的发育、根冠细胞的死亡、生物胁迫和环境胁迫、植物单性花的发育以及木质部细胞的发育等过程中都起着至关重要的作用。研究证明，木本植物木质部导管和纤维分子的发育过程是典型的细胞程序性死亡过程，但两种类型细胞又存在着不同的死亡方式。木质部导管死亡的过程为液泡裂解类型的死亡，从维管形成层分化出来后，几天内迅速死亡，属于快速死亡的过程；木质部纤维的死亡过程为非液泡裂解依赖类型的死亡，属于慢性死亡的过程，因此不同的细胞程序性死亡过程，可能具有不同的调控机制。
[0004]传统的细胞凋亡检测方法包括显微镜形态学观察、DNA凝胶电泳检测、TUNEL检测等方法。其中，显微镜检测，只能观测细胞形态变化；DNA凝胶电泳检测只能通过检测已降解的DNA判断细胞发生程序性死亡，但无法对不同细胞类型和细胞程序化死亡时期进行检测；TUNEL检测实验操作复杂，且在制作切片过程中可能存在DNA降解或机械损伤等，检测效率低；因此，木本植物细胞程序性死亡的研究缺乏高效准确的检测方法，严重阻碍了该领域的基础研究进展。
[0005]流式细胞技术是20世纪70年代发展起来的技术，通过测量单细胞或生物颗粒的散射光和荧光强度快速分析其物理或化学性质，可以高速分析单位体积内的上万个细胞，并同时从一个细胞中测得多个特征参数进行定性或定量分析，其主要特点是检测速度快、检测参数多、可对不同类型细胞进行准确分析和分选。该技术已经在倍性分析、核型分析、细胞计数、DNA和RNA含量检测、转基因检测以及次级代谢产物累计检测等方面广泛应用，为植物学的研究提供了重要信息。流式细胞仪也可应用于细胞凋亡检测。凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩、核解聚、凋亡小体形成、胞浆浓缩、体积减小等形态学上的特征，经过流式细胞仪的前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)分析后，即可区分出凋亡细胞和正常细胞，可以定量检测凋亡细胞数量。
[0006]目前，流式细胞技术在动物细胞凋亡检测过程发挥重要作用，草本植物研究中也有应用，但在木本植物中却没有报道。木本植物细胞程序性死亡不同于草本植物，是木材形
成过程中的重要生物学过程，但是，受限于一系列的技术障碍，现有木本植物细胞凋亡的TUNEL检测技术操作步骤繁琐，重复性差，难以精准定量，且不能对细胞程序性死亡过程的相关基因进行转录水平的表达量分析，不能满足木本植物细胞程序性死亡的转录水平检测需要。
[0007]本专利技术以杨树为植物材料，利用原生质体分离技术结合不同荧光染料，通过流式分选以及标记基因表达分析等，建立木本植物细胞程序性死亡的检测方法，解决现有检测方法耗时长、重复性差、无法精准定量等缺点，可以快速准确观察和分析木质部不同细胞类型程序性死亡时期和统计细胞数量，同时可以分选不同凋亡类型或时期细胞进行组学研究及凋亡相关基因转录水平检测，对木本植物细胞程序化死亡研究具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术不足，提供一种基于流式细胞分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，以杨树为植物材料，在原生质体分离、悬浮液制备、流式分析参数确定、流式分选以及分选鉴定等环节进行优化，探索木本植物细胞程序性死亡的检测方法。解决现有检测方法耗时长、重复性差、无法精准定量等缺点，同时解决现有检测方法无法对凋亡细胞取样及相关基因检测的技术问题。
[0009]为了实现所述专利技术目的，本专利技术提供了一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0010]1、将待检测木本植物茎段剥皮后，进行木质部细胞原生质体酶解，得到木质部原生质体细胞；
[0011]2、将步骤1中得到的木质部原生质体细胞进行离心悬浮处理，获得原生质体浓缩液；
[0012]3、向步骤2中得到的原生质体浓缩液中添加AnnexinV
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FITC，孵育处理后，继续加入PI染色处理，获得荧光染料染色的木质部原生质体细胞液；
[0013]4、对步骤3中得到的木质部原生质体细胞液进行成像流式拍照检测，生成AnnexinV
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FITC/PI散点图，并获得阴性细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞的染色及细胞形态成像图；
[0014]5、对步骤3中得到的木质部原生质体进行分选，并分别收集分选后细胞程序性死亡不同时期的亚群细胞；
[0015]6、对步骤5分选后的原生质体显微拍照，观察分选后细胞程序性死亡不同时期的亚群细胞形态；
[0016]7、利用RT
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qPCR对步骤5分选后不同亚群细胞，进行细胞凋亡和木质部发育相关基因的表达量分析。
[0017]优选地，步骤1中所述木本植物为杨树。
[0018]优选地，步骤1中，酶解的具体步骤如下：
[0019](1)温室培养2月龄银腺杨84K(P.alba X P.glandulosa)，分离表皮和树干；
[0020](2)加入30ml酶解液：0.6M D
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mannitol；20mM MES pH5.7；1.5％纤维素酶R
‑
10；0.4％果胶酶Y
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23；20mM KCL；10mM CaCl2；0.1％ BSA，到50ml离心管中，将剥皮后的树干放进装有酶解液的离心管中，25℃避光酶解40min；
[0021](3)将酶解后的树干取出来，放在30ml的W5溶液中：2mM pH5.7 MES、3M NaCl、1M CaCl2、2M KCl；轻轻晃动树干，让酶解后的细胞落到W5溶液中；
[0022](4)将W5溶液用70μm细胞筛过滤，200g离心5min；
[0023](5)去掉上清液，W5溶液重悬细胞，200g离心5min；
[0024](6)W5溶液重悬细胞，调整细胞浓度约106cells/ml，得到木质部原生质体细胞浓缩液。
[0025]优选地，步骤3中用AnnexinV
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FITC和PI进行染色的具体步骤如下：
[0026](1)上述木质部原生质体细胞浓缩液中，按100μl细胞液加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，包括如下步骤：(1)将待检测木本植物茎段剥皮后，进行木质部细胞原生质体酶解，得到原生质体酶解细胞；(2)将步骤(1)中得到的原生质体酶解细胞进行离心悬浮处理，获得原生质体浓缩液；(3)向步骤(2)中得到的原生质体浓缩液中添加AnnexinV
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FITC，孵育处理后，继续加入PI染色处理，获得木质部原生质体染色液；(4)对步骤(3)中得到的木质部原生质体染色液进行流式拍照检测，生成AnnexinV
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FITC/PI散点图，并获得阴性细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞的染色及细胞形态成像图；(5)对步骤(3)中得到的木质部原生质体染色液中的细胞进行分选，并分别收集不同时期细胞程序性死亡的亚群细胞；(6)显微拍照，分别观察对步骤(2)、步骤(3)分选前和分选后不同细胞程序性死亡时期的亚群细胞形态；(7)RT
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qPCR分析步骤(3)中分选后不同亚群细胞，细胞凋亡和材性发育相关基因的表达量。2.如权利要求1所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述木本植物为杨树。3.如权利要求2所述基于流式分选的木本植物细胞程序性死亡检测方法，其特征在于：步骤(1)中，酶解的具体步骤如下：1)温室培养2月龄银腺杨84K，分离表皮和树干；2)加入30ml酶解液：0.6M D
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mannitol；20mM MES pH5.7；1.5％纤维素酶R
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10；0.4％果胶酶Y
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23；20mM KCL；10mM CaCl2；0.1％BSA，到50ml离心管中，将剥皮后的树干放进离心管中，25℃避光放置，酶解40min；3)将酶解后的树干取出来，放在30m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖丽，赵树堂，郭英华，胡梦璇，赵新伟，卢孟柱，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：