反转录病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及反转录病毒基因转移载体，尤其慢病毒载体，其经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】反转录病毒载体


[0001]本专利技术涉及反转录病毒基因转移载体，尤其慢病毒载体，其经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化，包含启动子及转殖基因；及其制备方法。

技术介绍

[0002]反转录病毒为编码酶反转录酶之RNA病毒科(反转录病毒科(Retroviridae))。慢病毒为反转录病毒科之一属，且特征在于长潜伏期。反转录病毒，及尤其慢病毒，可将大量病毒RNA递送至宿主细胞之DNA中，且在反转录病毒中具有能够感染非分裂细胞之独特能力，因此其为基因递送载体之最有效方法之一。
[0003]假型化为产生病毒或病毒载体与外来病毒外膜蛋白之组合的方法。因此，外来病毒外膜蛋白可用于改变病毒颗粒之宿主趋向性或提高/降低稳定性。举例而言，假型化允许我们指定外膜蛋白的特征。常用于假型化反转录病毒及慢病毒载体之蛋白质为水泡性口炎病毒(VSV)之醣蛋白G，简称VSV
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G。
[0004]慢病毒载体，尤其衍生自HIV
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1之载体，为广泛研究且常用之载体。慢病毒载体骨架之演进及病毒将重组DNA分子(转殖基因)递送至目标细胞中之能力使得其用于许多应用。病毒载体之两种可能应用包括在基因疗法中恢复功能基因及活体外重组蛋白生产。
[0005]在设计适用作基因递送载体之反转录病毒/慢病毒载体时，一个关键驱动因素为使载体对于患者尽可能安全。第二个关键驱动因素为需要产生足够量之载体，不仅治疗个别患者，而且使可受益于疗法之所有患者可更广泛临床获取该疗法。此两个驱动因素本身可能冲突，因为改良载体安全性之修饰通常与载体生产期间减少之产量相关。
[0006]将受益于基因转移至气道上皮之临床环境的一个实例为囊肿性纤维化(CF)之治疗。CF为由CF跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因突变引起之致死性遗传病症，该蛋白充当气道上皮细胞中之氯离子通道。CF的特征在于复发性胸部感染、气道分泌物增加及最终呼吸衰竭。在英国中，当前中值死亡年龄为约25岁。对于大部分基因型，不存在靶向基本缺陷之治疗；当前用于症状缓解之治疗需要每天数小时之自投与疗法。不同于小分子药物，基因疗法与CFTR突变类别无关且因此适用于所有受影响CF个体。然而，迄今为止，尚无病毒载体批准用于临床用于CF治疗，且上述情况适用于其他疾病，尤其许多其他呼吸道疾病。
[0007]除患者安全性及产量问题之外，存在习知与基因转移至气道上皮相关之其他困难。
[0008]向气道上皮之基因转移效率一般不良，至少部分因为许多病毒载体之各别受体似乎主要位于气道上皮之底外侧表面。因此，在本专利技术人之研究之前，使用慢病毒假型需要破坏上皮完整性以转导气道，例如通过使用清洁剂，诸如溶血磷脂酰胆碱或乙二醇双(2
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胺基乙基醚)
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N,N,N'N'
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四乙酸，与败血症风险增加有关。另外，习知基因转移载体难以穿透呼吸道黏液层，此亦降低基因转移效率。重复投与习知病毒载体之能力(对于自我更新之上皮的终身治疗为必备的)由于患者之适应性免疫反应而受到限制，此阻止成功重复投与。
[0009]用于临床应用之载体投与为另一相关因素。因此，必须维持经由使用临床相关装置(例如支气管镜及喷雾器)之病毒稳定性以达到治疗功效。
[0010]因此，需要能够规避上文所描述之一或多种问题的基因疗法载体。特定言之，本专利技术之一个目标为提供一种用于产生假型化反转录病毒或慢病毒(例如SIV)载体之方法，及用于进行该方法之手段，其中所得载体为安全的且适用于改良跨气道上皮之基因转移效率，且以临床相关规模产生。

技术实现思路

[0011]诸位专利技术人先前开发了一种慢病毒载体，其已经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化，包含启动子及转殖基因。通常，载体之骨架来自猿猴免疫缺乏病毒(SIV)，诸如SIV1或非洲绿猴SIV (SIV
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AGM)。优选地，本专利技术之病毒载体的骨架来自SIV
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AGM。HN及F蛋白分别用于连接至唾液酸及介导细胞融合以便载体进入目标细胞。诸位专利技术人发现此特异性F/HN假型化之慢病毒载体可有效转导气道上皮，使得转殖基因表现维持时段超过所提出之气道上皮细胞的寿命。重要的是，诸位专利技术人亦发现再投与不会导致功效损失。此等特征使本专利技术之载体成为治疗疾病的有吸引力的候选者，这是经由其在如下表现治疗蛋白中之用途：(i)在呼吸道细胞内；(ii)分泌于呼吸道内腔中；及(iii)分泌于循环系统中。
[0012]然而，此慢病毒载体存在潜在安全性问题。特定言之，基因体载体与其生产中所用之GagPol载体之间存在显著程度的序列同源性。此序列同源性产生可能在制造期间或在临床使用中向患者投与之后产生复制胜任型慢病毒(RCL)的理论风险。此代表对患者之安全风险。产生复制胜任型病毒颗粒之风险亦为其他反转录病毒/慢病毒载体之问题。
[0013]尽管减轻此风险将合乎需要，但如此做并不简单，或至少在不诱发其他不可接受的缺点之情况下并不简单。特定言之，此项技术中公认旨在降低RCL风险之修饰(诸如制造gag
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pol基因之密码子优化)通常不利地影响载体之效价或产量。鉴于即使治疗单个患者亦需要大载体效价，此类产量降低具有致使其生产在商业上不可行的潜能。
[0014]诸位专利技术人现已首次证明，使用来自SIV之经密码子优化的gag
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pol基因不会不利地影响经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化之SIV载体的制造效价，且可甚至引起载体效价提高。鉴于在正常制造条件下(当载体基因体质体而非gag
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pol基因为限制性的时)，gag
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pol基因之密码子优化通常减少载体产量，这是出人意料的。
[0015]因此，诸位专利技术人首次提供一种用于产生经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化之反转录病毒，尤其慢病毒载体(诸如SIV)的方法，其中RCL风险降低，而不会不利地影响载体效价，或甚至提高载体效价。因此，本专利技术之方法提供以商业上期望之产量产生的较安全载体。
[0016]因此，本专利技术提供一种产生反转录病毒之方法，该反转录病毒载体经来自呼吸道副黏液病毒之血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化，且其包含启动子及转殖基因，其中该方法包含使用经密码子优化的gag
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pol基因。优选地，反转录病毒载体为慢病毒载体，且视情况该慢病毒载体选自由以下组成之群：猿猴免疫缺乏病毒(SIV)载体、人类免疫缺乏病毒(HIV)载体、猫免疫缺乏病毒(FIV)载体、马传染性贫血病毒(EIAV)载体及
比斯奈/梅迪(Visna/maedi)病毒载体。尤其优选为产生SIV载体之方法。
[0017]经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生反转录病毒载体的方法，其特征在于，该反转录病毒载体经来自呼吸道副黏液病毒的血球凝集素
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神经胺糖酸酶(HN)及融合(F)蛋白假型化，且其包含启动子及转殖基因，其中该方法包含使用经密码子优化的gag
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pol基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该反转录病毒载体为慢病毒载体。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该慢病毒载体选自由以下组成的群：猿猴免疫缺乏病毒(SIV)载体、人类免疫缺乏病毒(HIV)载体、猫免疫缺乏病毒(FIV)载体、马传染性贫血病毒(EIAV)载体及比斯奈/梅迪(Visna/maedi)病毒载体。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，该慢病毒载体为SIV载体。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述经密码子优化的gag
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pol基因为SIV gag
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pol基因。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述经密码子优化的gag
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pol基因包含与SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性的核酸序列或由其组成。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述经密码子优化的gag
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pol基因包含SEQ ID NO: 1的核酸序列或由其组成。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述经密码子优化的gag
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pol基因包含于质体中，该质体包含与SEQ ID NO: 5具有至少80%序列一致性的核酸序列或由其组成。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述经密码子优化的gag
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pol基因包含于质体中，该质体包含SEQ ID NO: 5的核酸序列或由其组成。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该呼吸道副黏液病毒为仙台病毒(Sendai virus)。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所产生的反转录病毒载体的效价为：a)等效于通过不使用经密码子优化的gag
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pol基因的对应方法产生的反转录病毒载体的效价；或b)与通过不使用经密码子优化的gag
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pol基因的对应方法产生的反转录病毒载体的效价相比提高。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该反转录病毒载体的效价比通过不使用经密码子优化的gag
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pol基因的对应方法产生的反转录病毒载体的效价高至少2倍或至少2.5倍。13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该启动子选自由以下组成的群：巨细胞病毒(CMV)启动子、延长因子1a (EF1a)启动子及杂合人类CMV强化子/EF1a (hCEF)启动子。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该载体包含杂合人类CMV强化子/EF1a (hCEF)启动子。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该转殖基因选自：a)分泌性治疗蛋白，视情况为α
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1抗胰蛋白酶(A1AT)、因子VIII、界面活性蛋白B (SFTPB)、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、温韦伯氏因子(von Willebrand Factor)、颗粒球
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巨噬细胞群落刺激因子(GM
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【专利技术属性】
技术研发人员：黛博拉，
申请(专利权)人：IP二IPO创新有限公司，
类型：发明
国别省市：