光控的病毒转导制造技术

本发明专利技术涉及一种具有生物活性的试剂盒，所述试剂盒包括包含第一蛋白的第一靶标和包含第二蛋白的第二靶标，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白适于在用UV、第一波长范围的可见光或红外光照射或在黑暗中形成异二聚体，所述异二聚体可以用UV、在第二波长范围的可见光或红外光照射或在黑暗中逆转，其中第二波长范围不同于第一波长范围，其中生物活性包括触发DNA、RNA、蛋白或小分子摄取到优选未修饰遗传的细胞中，以及生物效应，并且其特征在于第一和第二靶标中的至少一个本身与异二聚体相比具有降低的生物活性。降低的生物活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光控的病毒转导

技术介绍

[0001]单细胞测序和最近的单细胞多模式组学方法正在为生物技术和医学应用开辟新的途径。为了在多细胞系统中利用这些新的可能性，需要开发单细胞规模的哺乳动物细胞工程技术。然而，目前的单细胞基因工程技术，如显微注射、单细胞电穿孔或基于激光诱导的细胞膜穿孔的光学转染，由于高侵袭性、低通量和对复杂仪器的要求，并不能广泛应用。尽管光遗传学可以用于光学控制单个细胞的过程，但它需要事先将遗传信息转移到细胞集合中，使其对光有反应。这会阻止原代细胞和组织的使用或使其复杂化，并可能通过多效副作用影响周围的脱靶细胞。本专利技术以一种令人惊讶的方式克服了这些问题和限制。

技术实现思路

[0002]技术问题
[0003]因此，本专利技术的目的是克服上述缺点。
[0004]特别地，本专利技术的目的是允许单细胞(优选基因)工程，而不使用显微注射、单细胞电穿孔或基于激光诱导细胞膜穿孔的光学转染。
[0005]本专利技术的另一个目的是提供用于在单细胞规模上将未遗传修饰细胞工程化的技术。
[0006]本专利技术的一个目的是提供单细胞(优选基因)工程，其可以由低剂量的细胞友好光，优选不是UV启动。优选地，单细胞工程的启动与光照相称。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供单细胞(优选基因)工程，其不需要细胞表面结构的主动内化，所述结构靶向单细胞工程。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供一种单细胞(优选基因)工程，其不影响单细胞工程靶向的细胞表面结构。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供一种用于单细胞(优选基因)工程的试剂盒，其一旦被激活，也可以通过低剂量的细胞友好光(优选不是UV)去激活。
[0010]本专利技术的一个目的是提供一种通过使用低剂量细胞友好光(优选不是UV)的局部受限光束来局部工程化细胞簇的工具，同时保留周围的细胞。
[0011]本专利技术的目的是提供(优选基因)工程，其可以通过在红色或近红外范围内选定波长范围的简单照明随时间调整。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供快速的细胞工程，优选遗传细胞工程。
[0013]本专利技术的目的是提供一种可以含有工程化细胞和非工程化细胞的组织。
[0014]本专利技术的另一个目的是提供准确性提高的(优选遗传)细胞工程。
[0015]本专利技术的另一个目的是提供稳定的(优选遗传)细胞工程，例如不被中和。
[0016]问题的解决方案
[0017]出人意料地，独立权利要求的主题解决了所有这些目的。
[0018]本专利技术通过光学引导分子(例如遗传信息)选择性转移到单个靶细胞中，克服了上述限制。本专利技术(i)不需要事先对靶细胞基因工程化，(ii)依赖于用于光学刺激的标准硬件
(例如发光二极管或常规共聚焦显微镜)，(iii)与永生化细胞和原代细胞兼容，以及(iv)依赖于非侵入性光。(v)由于转移(如基因递送)在细胞进入的水平上(如病毒)受到控制，它将对脱靶邻近细胞的影响降至最低。本专利技术的一个实施方案涉及OptoAAV，其基于腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体在基础研究和临床许可的基因治疗中作为基因递送载体发挥关键作用。AAV载体是无包膜的单链DNA载体，其转导分裂细胞和非分裂细胞，并且由于缺乏AAV相关的病理和附加型持久性而提供极好的安全性。因此，OptoAAV技术优选包括工程化腺相关病毒(AAV)载体系统(AAV
‑
2)和介导AAV与靶标选择性相互作用的光响应性接头蛋白(例如PhyB)。例如，对病毒载体进行基因修饰以使对其天然细胞受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)不敏感，并暴露衣壳表面上的光敏色素相互作用因子6(PIF6；氨基酸1
‑
100)。
[0019]专利技术的有利效果
[0020]本专利技术的一个优点是可以使用未遗传修饰的细胞。当然，本专利技术也适用于转基因细胞。
[0021]由于根据本专利技术的各种示例性实施方案的试剂盒包括包含第一蛋白的第一靶标和包含第二蛋白的第二靶标，其中第一蛋白和第二蛋白在照射(例如用特定波长范围的可见光或红外光)或在黑暗中可逆地形成异二聚体，试剂盒可以很容易地被激活，从而表现出生物活性。
[0022]此外，由于异二聚体的形成是可逆的(使用例如特定波长范围内的可见光或红外光，该特定波长范围不同于异二聚体形成的波长范围或在黑暗中)，因此试剂盒也可以容易地去活化。
[0023]使用包含可以形成异二聚体的两种不同蛋白的两个单独靶标，确保了生物活性受到控制，而不是偶然事件的结果。本专利技术的细胞工程的效率(例如转导效率)优选为至少50％，更优选至少55％，进一步优选至少60％。如果细胞工程依赖于编码荧光蛋白的基因的转导，则转导效率可以例如通过测定荧光细胞来测定。
[0024]由于生物活性基本上只能通过用UV、特定波长范围的可见光或红外光照射试剂盒或在黑暗中发生，因此生物活性可以通过控制照射来控制。
[0025]由于异二聚体的形成是在温和的条件下发生的，因此活细胞不会受到本专利技术的试剂盒的负面影响。特别地，本专利技术不需要并且可以在没有被异二聚体靶向的细胞表面结构的主动内化的情况下进行。当然，本专利技术通常不排除内化(例如脂质体或特异性病毒载体)。此外，本专利技术不需要并且可以在不影响被异二聚体靶向的细胞表面结构的情况下进行，使得诸如受体活化和/或信号转导的生物效应作为靶向的结果而启动。当然，本专利技术一般不排除受体活化和/或信号转导。
[0026]此外，由于试剂盒可以在温和的条件下快速去活化，因此可以很容易地以时空方式对细胞进行工程改造。
[0027]此外，该试剂盒还可应用于再生医学、组织工程、基因治疗或基础研究。
[0028]此外，该试剂盒可应用于生物体，包括动物，尤其是人类。
附图说明
[0029]图1示出了光控病毒转导系统的设计和功能模式。
[0030]图2示出了OptoAAV系统组件的特性。
[0031]图3示出了OptoAAV系统的特性。
[0032]图4示出了OptoAAV系统对不同细胞类型的模块化适应。
[0033]图5示出了时空控制的转导。
[0034]图6示出了使用常规共聚焦显微镜的单细胞的空间分辨转导。
[0035]图S1示出了固定化金属亲和层析(IMAC)纯化后通过SDS
‑
PAGE对不同PhyB
‑
DARPin接头蛋白的分析。
[0036]图S2示出了不同纯化的PhyB DARPin接头蛋白的光谱分析。
[0037]图S3示出了PhyB DARPin
EGFR
和PIF6之间的光依赖性蛋白相互作用。
[0038]图S4示出了PhyB和PhyB DARPin
EGFR
与A
‑
431细胞的结合。
[0039]图S5示出了mVenus
‑
PIF6向细胞表面的光控募集。
[0040]图S6示出了本研究中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具有生物活性的试剂盒，所述试剂盒包括
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包含第一蛋白的第一靶标，
‑
包含第二蛋白的第二靶标，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白适于在用UV、第一波长范围内的可见光或红外光照射时或在黑暗中形成异二聚体，所述异二聚体可任选地在用UV、第二波长范围内的可见光或红外光照射时或在黑暗中逆转，其中所述第二波长范围不同于所述第一波长范围，其中所述生物活性包括触发DNA、RNA、蛋白或小分子摄取到优选未遗传修饰的细胞中，以及生物效应，并且其特征在于，与异二聚体相比，第一和第二靶标中的至少一个自身具有降低的生物活性。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一靶标适合结合在细胞上表达的脂质或蛋白或其组合，优选受体或其部分，所述细胞优选未遗传修饰的细胞。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中第一靶标与脂质或蛋白或其组合，优选受体或其部分的结合不触发生物效应。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的试剂盒，其中所述第二靶标基本上不适合吸附或结合细胞，所述细胞优选未遗传修饰的细胞。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的试剂盒，其中所述第二靶标包含至少一种分子，所述分子适于导致以下分子过程发生的变化：基因表达、DNA合成、基因沉默、RNA合成，优选基因转录、蛋白合成、肽合成、翻译后修饰，优选糖基化、磷酸化、泛素化、苏木化、甲基化或乙酰化；细胞生长；自噬；线粒体自噬；细胞死亡；细胞分裂；细胞增殖；细胞存活；细胞分化；细胞老化；细胞器生长；细胞器增殖；细胞骨架的聚合或解聚；病毒复制；逆转录；核苷磷酸化；核苷酸磷酸化；细胞凋亡、坏死或抗原呈递。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的试剂盒，其中所述第二靶标包括脂质体、外泌体、DNA；优选病毒DNA和/或自杀基因；RNA，优选病毒RNA；蛋白，优选逆转录酶、病毒胸苷激酶、病毒胞苷激酶、病毒腺嘌呤激酶、病毒鸟嘌呤激酶、毒力因子、病毒整合酶、蛋白酶、凋亡因子、具有核受体的激素，优选类固醇激素、甲状腺激素、维生素D、视黄酸、NGF1
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b；SF1样蛋白或GCNF样蛋白；转录因子；小分子，优选活性成分。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的试剂盒，其中所述第二靶标包含病毒蛋白或其衍生物，优选逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、水疱性口腔炎病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克西米利安，
申请(专利权)人：阿尔贝特路德维希斯弗赖堡大学，
类型：发明
国别省市：