一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法技术

本发明专利技术涉及一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法，采用如下步骤：(1)大分子或中分子透明质酸中添加酶，通过酶解得到透明质酸酶解液；(2)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，配制供试品溶液；(3)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，与内毒素标准溶液混合，配制阳性对照溶液；(4)分别检测供试品溶液和对照溶液的内毒素含量。本发明专利技术通过酶解大分子或中分子透明质酸，将内毒素完全释放出来，避免了内毒素被包裹无法被检出，从而提高了检测的准确度，从而快速评估透明质酸样品的质量，对完善该品种的质量控制具有重要的指导意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(钠)又名玻尿酸、玻璃酸(HA)，是一种酸性粘多糖，由D
‑
葡萄糖醛酸以及N
‑
乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位构成的大型多糖类。其大量存在于生物体内的许多组织，例如皮下组织、眼球、关节等。与其他多糖类相比较，透明质酸不含硫，其分子能携带500倍以上的水分，是当今公认的最佳保湿成分，广泛应用于化妆品、保健品、食品、医疗美容和医药等领域中。
[0003]透明质酸或其钠盐中的细菌内毒素主要来源于生产过程中使用的物料以及环境中可能引入的革兰氏阴性菌，菌体自溶或被裂解时产生细菌内毒素，其可以引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等不良反应。为了保证使用上的安全性，需要严格控制内毒素的含量，以达到化妆品、保健品、食品、医疗美容和医药等领域中内毒素含量标准。国家药品标准中规定，透明质酸钠中含内毒素的量：眼内注射用应小于0.5EU/mg，关节内注射用应小于0.05EU/mg。医药行业标准《YY/T 1571
‑
2017组织工程医疗器械产品
‑
透明质酸钠》也规定细菌内毒素应小于0.05EU/mg，而老版本标准YY/T0606.9
‑
2007中的细菌内毒素规定为小于0.5EU/mg，可见对透明质酸中细菌内毒素含量的要求越来越严格。
[0004]现有技术CN1327227C公开了一种检测透明质酸钠原料的细菌内毒素含量的方法，但是在实际分析过程中发现，使用细菌内毒素检查用水稀释大分子透明质酸后，直接进行细菌内毒素的检测，存在细菌内毒素的回收率指标无法满足50％～200％要求的情况，从而导致分析试验无效。因此，现有技术的方法无法准确检测难溶的大分子或中分子透明质酸中包裹的内毒素含量(高分子量或中等分子量透明质酸钠加水后形成透明胶状，流动相极差)，从而带来了较大的安全隐患。
[0005]基于现有技术存在的上述问题，因此迫切需要寻找一种新的分析方法来准确测定透明质酸中细菌内毒素的含量。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种新的测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法，以解决现有技术中存在的回收率不满足要求，无法准确检测难溶的大分子或中分子透明质酸中包裹的内毒素含量，从而带来较大的安全隐患问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案，一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法，包括如下步骤：
[0008](1)大分子或中分子透明质酸中添加酶，通过酶解得到透明质酸酶解液；
[0009](2)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，配制供试品溶液；
[0010](3)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，与内毒素标准溶液混合，配制阳
性对照溶液；
[0011](4)使用鲎试剂分别检测供试品溶液和对照溶液的内毒素含量。
[0012]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中使用的酶可以使大分子或中分子透明质酸的分子量减小，促进其包裹的内毒素的充分释放。
[0013]作为本专利技术的一种实施方式，所述酶可选为透明质酸酶或硫酸软骨素酶等中的一种或两种的组合。
[0014]作为本专利技术的一种实施方式，所述透明质酸酶可选为从原核生物获得或从真核生物获得的。从作用机制和产物角度分析，透明质酸酶可分为三类：第一类为透明质酸
‑3‑
糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，对底物有一定的专一性，从水蛭中提取获得，作用于HA的β
‑
1,3
‑
糖苷键，主要产物是HA4和HA6。第二类是透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1)，从微生物中提取获得，产物以4,5
‑
不饱和双糖为主，透明质酸的β
‑
1,4
‑
糖苷键通过β
‑
消除反应来裂解。第三类为透明质酸
‑4‑
糖基水解酶家族(EC 3.2.1.35)，具有转糖苷和水解活性，从哺乳动物中提取获得，作用于透明质酸的β
‑
1,4
‑
糖苷键，四糖是主要产物。
[0015]作为本专利技术的一种实施方式，所述酶解时间可选约为0.5～10h，酶解温度约为35℃～40℃。作为本专利技术的一种更具体的实施方式，所述酶解时间约为1
±
0.5h、2
±
0.5h、3
±
0.5h、4
±
0.5h、5
±
0.5h、6
±
0.5h、7
±
0.5h、8
±
0.5h、9
±
0.5h；酶解温度约为36
±
0.5℃、37
±
0.5℃、38
±
0.5℃或39
±
0.5℃，其中37
±
0.5℃温度下透明质酸酶的活性最高。
[0016]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中酶的浓度可选为0.01mg/mL～1mg/mL，进一步可选为0.1mg/mL。
[0017]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中大分子透明质酸分子量约为＞1000KDa，进一步可选约为1200KDa～2000KDa，具体的大分子透明质酸分子量实例如1300KDa、1500KDa、1600KDa、1800KDa或2000KDa。所述步骤(1)中的中分子透明质酸分子量约为10KDa～1000KDa，进一步可选约为100KDa～1000KDa，具体的中分子透明质酸分子量实例如10KDa、20KDa、80KDa、100KDa、200KDa、300KDa、500KDa或1000KDa。
[0018]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中大分子或中分子透明质酸的浓度可选为1～100mg/mL，如进一步可选为9mg/mL或10mg/mL。
[0019]作为本专利技术的一种实施方式，大分子透明质酸约为1200KDa～2000KDa，酶解约1h，所得的回收率满足要求。
[0020]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中酶与大分子或中分子透明质酸的体积比约为0.1～10：1，如进一步可选为1：1。
[0021]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(2)和步骤(3)中稀释的倍数不超过最大有效稀释倍数，如可选为不超过100倍，如进一步可选为5倍～50倍，或8倍～20倍，更具体可选为15倍。
[0022]最大有效稀释倍数(MVD)的计算公式为：
[0023]MVD＝(细菌内毒素限值L
×
供试品溶液的浓度C)/标准曲线的最低内毒素浓度λ
[0024]例如当细菌内毒素限值控制在0.05EU/mg，供试品溶液的浓度为10mg/mL，标准曲线的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定透明质酸中细菌内毒素含量的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)大分子或中分子透明质酸中添加酶，通过酶解得到透明质酸酶解液；(2)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，配制供试品溶液；(3)用细菌内毒素检查用水稀释透明质酸酶解液，与内毒素标准溶液混合，配制阳性对照溶液；(4)使用鲎试剂分别检测供试品溶液和对照溶液的内毒素含量。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)中使用的酶可以使大分子或中分子透明质酸的分子量减小，促进其包裹的内毒素的充分释放。3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述步骤(1)中使用的酶选自透明质酸酶或硫酸软骨素酶中的一种或两种的组合。4.根据权利要求1～3任一项所述的分析方法，其特征在于：所述酶的酶解时间为0.5～10h，酶解温度为35℃～40℃。5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于：所述酶的酶解时间为1
±
...

【专利技术属性】
技术研发人员：邰玉凯，王慧，黄衫，
申请(专利权)人：南京乐韬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：