本发明专利技术提供了一种基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，属于内毒素检测技术领域。本发明专利技术主要包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制；(2)供试品系列稀释溶液的配制；(3)供试品加标系列溶液的配制；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。本发明专利技术采用重组C因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50EU/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行。方法可行。方法可行。
【技术实现步骤摘要】
基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法
[0001]本专利技术属于内毒素检测
，尤其涉及一种基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法。
技术介绍
[0002]《中国药典》2020年版二部氟胞嘧啶注射液收载了热原检查项，该方法存在动物源性的个体差异，灵敏度不高，检测结果不能定量，标准化实验过程过长，且不符合动物3R原则。
[0003]凝胶法为细菌内毒素检查的经典方法，操作简单，灵敏度高，干扰因素少，结果重现性好，替代热原检查法成为必然。但又因细菌内毒素检查法中凝胶法及光度法所需的鲎试剂原材料未来可能限制生产。
[0004]所以本领域亟需一种可避免因鲎试剂限制导致无法进行细菌内毒素检查的全新检测方法。
技术实现思路
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法。本专利技术主要包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制；(2)供试品系列稀释溶液的配制；(3)供试品加标系列溶液的配制；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。本专利技术采用重组C因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50EU/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，包括如下步骤：
[0008](1)标准品系列溶液的配制：
[0009]配置5.0EU/ml、1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.05EU/ml、0.005EU/ml标准品系列溶液；
[0010](2)供试品系列稀释溶液的配制：
[0011]配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液；
[0012](3)供试品加标系列溶液的配制：
[0013]配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品加标系列溶液，其中每一浓度的供试品加标溶液中均含有0.50EU/ml浓度的细菌内毒素；
[0014](4)加样并预热；
[0015](5)加入底物试剂进行检测。
[0016]优选的，所述步骤(2)的具体过程为：根据MVD＝cL/λ计算，供试品MVD溶液为100倍稀释液，取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列
稀释溶液，其中100倍的供试品稀释溶液为供试品MVD溶液。
[0017]优选的，所述步骤(3)的具体过程为：首先取供试品，使用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、50倍的供试品系列稀释溶液，然后取原液及所述供试品系列稀释溶液，加入1.0EU/ml的标准品溶液，使每一浓度的试验液中均含有0.50EU/ml浓度的细菌内毒素，供试品的最终稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、100倍，其中100倍的供试品稀释溶液为供阳MVD溶液。
[0018]优选的，所述步骤(4)的具体过程为：将标准品系列溶液，阴性对照，供试品系列稀释溶液，供试品加标系列溶液依次加入到96孔无热原白板中，每孔加样量为100μl，加样后将96孔板放到36～38℃生化培养箱中预热5
‑
30分钟。
[0019]进一步优选的，其特征在于，所述步骤(4)中加样后将96孔板放到37℃生化培养箱中预热10
‑
20分钟。
[0020]优选的，所述步骤(5)的具体过程为：将平衡至室温的荧光底物溶液、测定缓冲液和rFC酶溶液按照5:4:1的比例轻轻混匀制成底物试剂，在预热的96孔板中每孔加入100μl底物试剂，将96孔板放到36～38℃培养箱中孵育0.9～1.1小时，将酶标仪检测参数设置为380nm激发波长和440nm发射波长，分别检测孵育前(RFU
0h
)和孵育1小时(RFU
1h
)的荧光值。
[0021]进一步优选的，所述步骤(5)中加入底物试剂后，将96孔板放到37℃培养箱中孵育1小时。
[0022]优选的，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法中氟胞嘧啶注射液细菌内毒素限值设定为：L＝0.50EU/ml。
[0023]优选的，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法还包括数据统计的步骤：RFU
1h
减去RFU
0h
得到荧光差值(ΔRFU)；将标准品和样品的ΔRFU减去阴性对照的ΔRFU，得到标准品和样品的净ΔRFU值；计算内毒素工作标准品平均净ΔRFU和浓度(EU/mL)的对数，以log(标准品浓度)为横坐标，log(净ΔRFU)为纵坐标绘图并进行线性拟合，R2应≥0.980；通过拟合曲线计算供试品系列稀释溶液和供试品加标系列溶液的内毒素含量，计算加标回收率：加标回收率％＝(内毒素浓度
加标
‑
内毒素浓度
未加标
)/加标内毒素浓度
×
100％，回收率在50％～200％之间认为样品无干扰，通过拟合曲线计算供试品MVD溶液，供阳MVD溶液的内毒素浓度，根据样品稀释倍数计算未稀释样品的内毒素浓度。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：
[0025](1)本专利技术采用重组C因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50EU/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行；
[0026](2)本专利技术中的方法消除了鲎试剂中β
‑
1,3
‑
葡聚糖导致的假阳性结果的干扰；不依赖动物源性成分，可提供更高的供应安全性；重组表达生产，产品批间一致性良好；灵敏度范围更高；符合3R的替代原则；具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例1中内毒素标准品的拟合曲线。
具体实施方式
[0028]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。
[0029]下面结合实施例，对本专利技术的技术方案进行进一步详细阐述。
[0030]实施例1重组C因子法
[0031]1材料与方法
[0032]1.1供试品：氟胞嘧啶注射液，回音必集团江西东亚制药有限公司生产，规格：250ml：2.5g，批号：2022052563、2022052564、2022030661。
[0033]1.2仪器：KB53生化培养箱；3001型酶标仪；ED115型恒温干燥箱。
[0034]1.3试剂试药：LonzaPyroGene...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制：配置5.0EU/ml、1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.05EU/ml、0.005EU/ml标准品系列溶液；(2)供试品系列稀释溶液的配制：配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液；(3)供试品加标系列溶液的配制：配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品加标系列溶液，其中每一浓度的供试品加标溶液中均含有0.50EU/ml浓度的细菌内毒素；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。2.根据权利要求1所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：根据MVD＝cL/λ计算，供试品MVD溶液为100倍稀释液，取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液，其中100倍的供试品稀释溶液为供试品MVD溶液。3.根据权利要求2所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体过程为：首先取供试品，使用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、50倍的供试品系列稀释溶液，然后取原液及所述供试品系列稀释溶液，加入1.0EU/ml的标准品溶液，使每一浓度的试验液中均含有0.50EU/ml浓度的细菌内毒素，供试品的最终稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、100倍，其中100倍的供试品稀释溶液为供阳MVD溶液。4.根据权利要求3所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体过程为：将标准品系列溶液，阴性对照，供试品系列稀释溶液，供试品加标系列溶液依次加入到96孔无热原白板中，每孔加样量为100μl，加样后将96孔板放到36～38℃生化培养箱中预热5
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30分钟。5.根据权利要求4所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中加样后将96孔板放到37℃生化培养箱中预热10
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦美蓉，王平，姜睿琪，陈润桦，王晓炜，陈宁，
申请(专利权)人：深圳市药品检验研究院深圳市医疗器械检测中心，
类型：发明
国别省市：
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