定量细菌生物膜中的内毒素负荷制造技术

本文公开了用于定量生物膜样品中的总内毒素负荷的方法。还提供了用于鉴定革兰氏阴性生物膜衍生的细菌感染的方法。所公开的方法更准确地定义实际的总内毒素水平，并且能够以比当前提取技术更高的分辨率来检测给定生物膜体积中内毒素的存在。体积中内毒素的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量细菌生物膜中的内毒素负荷
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年4月9日提交的美国临时申请号63/007,430的优先权权益，该申请的全部内容据此以引用方式并入。


[0003]本公开涉及定量生物膜中的内毒素的方法。

技术介绍

[0004]目前，许多医疗装置(诸如例如硬脑膜替代补片、疝网和伤口敷料)由细菌衍生的纤维素制造，该细菌衍生的纤维素是一种形式的生物膜。用于生产纤维素的某些细菌包括革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌特有的一个问题是内毒素的存在。内毒素，也称为脂多糖，是革兰氏阴性细菌的细菌细胞壁结构的一部分。它们是已知的热原，并且在从细胞壁释放时，诸如在细胞分裂或细胞死亡期间是体内炎症过程的贡献者。
[0005]为了获得监管批准，使用革兰氏阴性细菌或用革兰氏阴性细菌产生的产品必须进行处理以使它们无热原。
[0006]FDA批准的细菌内毒素测试(BET)标准是鲎变形细胞溶解物(LAL)测定。在ANSI/AAMI ST72:2011、USP<85>和USP<161>中概述了用于医疗装置的该测试。该测定涉及使样品与来自美洲鲎(Limulus Polyphemus)的变形细胞溶解物接触。该测定有三种变型形式，包括凝胶
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凝块技术、比浊技术和显色技术。凝胶
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凝块法是最简单和最广泛使用的LAL测试，并且依赖于凝胶的形成。比浊技术依赖于内源底物裂解后样品中浊度的发展。显色技术基于裂解合成肽
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色原复合物后样品中颜色的发展。在测试结果冲突的情况下，凝胶
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凝块测试被认为是决定性的测试方法。
[0007]目前，医疗装置上的BET依赖于间接提取方法来定量内毒素单位(EU)。通常将样品浸入无热原的水中并加热至接近体温(例如，37℃)持续至少一小时。取水中的提取物，并且用LAL测定测试内毒素量。从该间接测量来确定医疗装置的EU值。根据医疗装置的预期用途，FDA设定可接受的阈值EU值。
[0008]从临床角度来看，目前在患有生物膜衍生的细菌感染的患者中不易检测到生物膜。为了鉴定抗生素治疗过程，通常培养来自患者的组织样品，并且然后鉴定细菌生长。该过程是耗时的，并且只能测量在选定温育条件下能够在所选择的琼脂上生长的活细菌细胞的数量。在某些条件下，没有检测到来自生物膜样品的存活的革兰氏阴性细菌。在感染衍生自革兰氏阴性生物膜的情况下，内毒素的存在可提供鉴定患者体内生物膜感染的存在的替代方法。

技术实现思路

[0009]本公开涉及定量生物膜中的内毒素的方法。本文公开的方法更准确地定义实际的总内毒素水平，并且能够以比利用当前提取技术低得多的水平来检测给定生物膜体积中内
毒素的存在。因此，本文所述的方法是对本领域方法的当前状态的改进，并且可另外用于确定患有革兰氏阴性细菌感染的患者体内潜在的生物膜衍生的感染。
[0010]根据本公开，用于定量生物膜中内毒素浓度的方法包括以下步骤：
[0011]用酶消化生物膜样品以形成消化的生物膜样品；
[0012]将所消化的生物膜样品分离成上清液和细胞沉淀物；
[0013]将细胞沉淀物与细胞裂解剂组合以释放内毒素并形成内毒素悬浮液；
[0014]将内毒素悬浮液浓缩成内毒素样品和悬浮液上清液；以及，
[0015]对内毒素样品进行细菌内毒素测试(BET)测定以获得样品内毒素值。
[0016]根据某些实施方案，生物膜由纤维素组成；优选地，生物膜基本上由细菌衍生的纳米纤维素(BNC)组成。根据本公开，生物膜至少部分地由产生内毒素的微生物(例如，革兰氏阴性细菌)组成。在优选的实施方案中，革兰氏阴性细菌来自葡糖醋杆菌属。
[0017]在某些实施方案中，消化步骤可包括加热步骤。在某些实施方案中，用于消化的酶包括纤维素酶。在附加实施方案中，细胞裂解剂包含螯合剂和盐。
[0018]在某些实施方案中，该方法还可包括在进行BET测定的步骤之前稀释内毒素样品的步骤。根据另外的实施方案，该方法可包括将β
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葡聚糖抑制剂添加到内毒素样品中的步骤。在附加实施方案中，该方法还可包括对生物膜样品进行菌落形成单位(CFU)评估以获得CFU值，使得可以确定内毒素值和CFU值之间的关系。
[0019]本公开进一步公开了用于临床鉴定革兰氏阴性生物膜衍生的细菌感染的方法。该方法包括：
[0020]酶促消化哺乳动物组织样品以形成消化的组织样品；
[0021]将所消化的组织样品分离成上清液和细胞沉淀物；
[0022]将细胞沉淀物与细胞裂解剂组合以释放一定量的内毒素，其中内毒素的量具有为零的下限；
[0023]浓缩该量的内毒素，以及
[0024]对浓度进行细菌内毒素测试(BET)测定以获得组织样品内毒素值。
[0025]在某些实施方案中，生物膜由病原微生物组成，例如，来自肠杆菌科的革兰氏阴性细菌。
具体实施方式
[0026]在本文档中，除非另外指明，否则术语“一个”或“一种”用于包括一个/种或多于一个/种，并且术语“或”用于指非排他性的“或”。此外，应当理解，本文所采用的措辞或术语在未以另外的方式定义的情况下，仅用于描述的目的而非进行限制。当表示值的范围时，另一个实施方案包括从一个具体的值和/或到其他具体的值。相似地，当前面用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该值的具体值构成了另一个实施方案。所有范围均包括端值在内并且可组合。另外，对范围中所述的值的引用包括该范围内的每一个值。还应当理解，为了清楚起见，本文在单独实施方案的上下文中描述的本专利技术的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反地，本专利技术的各种特征为简明起见在单个实施方案的上下文中进行了描述，也可以分开提供或以任何子组合形式提供。
[0027]本公开涉及用于定量生物膜样品中的总内毒素负荷的方法。该方法可包括：
[0028]用酶消化生物膜样品以形成消化的生物膜样品；
[0029]将所消化的生物膜样品分离成上清液和细胞沉淀物；
[0030]将细胞沉淀物与细胞裂解溶液组合以释放内毒素并形成内毒素悬浮液；
[0031]将内毒素悬浮液浓缩成内毒素样品和悬浮液上清液；以及，
[0032]对内毒素样品进行细菌内毒素测试测定以获得样品内毒素值。
[0033]根据某些实施方案，生物膜由纤维素组成。关于植入式医疗装置的制造，在某些实施方案中，生物膜基本上由细菌衍生的纳米纤维素(BNC)组成。根据本公开，生物膜至少部分地由产生内毒素的微生物(例如，革兰氏阴性细菌)组成。在优选的实施方案中，革兰氏阴性细菌是葡糖醋杆菌。已知用于生产纤维素的其他革兰氏阴性细菌可包括例如固氮菌、根瘤菌、农杆菌、假单胞菌、沙门氏菌或产碱杆菌。
[0034]根据某些实施方案，生物膜样品是BNC薄膜。根据某些实施方案，样品薄膜的纤维素含量可为约1％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定量生物膜样品中的内毒素浓度的方法，包括：用酶消化所述生物膜样品以形成消化的生物膜样品；将所消化的生物膜样品分离成上清液和细胞沉淀物；将所述细胞沉淀物与细胞裂解剂组合以释放内毒素并形成内毒素悬浮液；将所述内毒素悬浮液浓缩成内毒素样品和悬浮液上清液；以及，对所述内毒素样品进行细菌内毒素测试(BET)测定以获得样品内毒素值。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化步骤还包括加热步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述加热步骤在约48℃至52℃的温度下进行。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化步骤在约12小时至约24小时的时间段内进行。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括纤维素酶。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括将所消化的生物膜样品离心。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞裂解剂包含螯合剂和盐。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述螯合剂包含EDTA
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HCl。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述盐包含Tris
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HCl。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述将所述细胞沉淀物与所述细胞裂解剂组合的步骤包括将来自所述细胞沉淀物的细胞悬浮在所述细胞裂解剂中。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述悬浮细胞的步骤包括加热到约22℃至约26℃的温度。12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，还包括搅拌约10分钟至约30分钟的时...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：德普伊新特斯产品公司，
类型：发明
国别省市：