用低剂量ＭＰＴＰ建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法技术

用低剂量ＭＰＴＰ建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法，属生命科学技术领域。给雄性猕猴低剂量肌肉注射ＭＰＴＰ三个月或三个月以上的时间，并进行行为观察、ＭＲＩ检测和ＳＰＥＣＴ检测。如果猴出现震颤，且在ＭＲＩ成像上观察到脑内黑质区有神经元缺损，在ＳＰＥＣＴ成像上显示纹状体有神经元缺损，则表明该猕猴就是成功建立的模型。行为观察时可根据Ｋｕｒｌａｎ帕金森氏病量表做行为评分，以评价猕猴帕金森病的严重程度，从而满足模型的使用者的不同要求。本方法成功建立了慢性灵长类帕金森病模型，能模拟人类帕金森病慢性进程。模型不仅有ＰＤ症状，也有ＤＡ能神经元选择性损伤的病理改变，可广泛用于ＰＤ发病机制、诊断及治疗方面的研究工作中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学
，具体涉及一种建立帕金森病灵长类动物模型的方法。
技术介绍
帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经系统退行性疾病。该病 一般在50岁至65岁开始发病，发病率随年龄增长而逐渐增加，60岁发病率约为1%。，70岁 发病率达3%。至5%。。帕金森病早期主要表现包括静止性震颤、肌强直、行动缓慢、动作启动 困难以及姿势异常等。静止性震颤即患者的手或臂不受控制地发抖，在休息时出现或情绪 紧张时加重；其他早期症状包括开始活动时感到困难，其后双臂和双腿经常震颤，上肢不能 作精细运动，乃致日常生活不能自理，如穿衣、洗漱感觉困难。帕金森病还常伴有抑郁、焦 虑、肢体酸痛不适、多汗、流涎等。因此，帕金森病给家庭社会带来沉重的负担。 当基底节中多巴胺(dopamine,DA)含量减少70%时，才开始出现临床症状。因此， 去医院就诊的帕金森病患者脑内已出现不可逆的损伤。要在疾病早期进行诊断，建立一个 合适的动物模型显得犹为重要。几十年来，研究者建立了多种多样的帕金森病动物模型。从 最早的利血平模型、甲基苯丙胺模型到6-羟多巴模型和1-甲基-4-苯基-1， 2， 3， 6-四氢 吡啶模型(MPTP模型)。最近发现系统的给予农药杀虫剂鱼藤酮能在大鼠模型上产生明确 的PD症状。 利血平和甲基苯丙胺都是通过耗竭脑内单胺类神经递质使动物出现骨骼肌僵硬、 震颤、舔毛等与帕金森症相似的症状。这两种模型都属于急性损伤模型，不能完全复制原发 性帕金森病的病理变化。并且实验对象为啮齿类动物，不能为人类帕金森病提供很好的信息。 6-0HDA与DA有很强的化学相似性，因此能在儿茶酚胺能神经元内特异性聚集，对 大鼠、小鼠、猫和灵长类动物均有神经毒性。6-0HDA(8 12iig)注射于纹状体或内侧前脑 束，可以造成大鼠的运动平衡障碍，如躯体弯曲、运动不能、肌强直等。随着病程延长，动物 会出现吞咽和呼吸困难。6-0HDA单侧损毁制备的PD动物模型在病理、生化方面的表现同 人类PD有不少相似之处，如黑质DA能神经元变性、死亡、缺失，胶质细胞增生，黑质和纹状 体TH活性及DA含量降低。另一优点是在系统注射DA受体激动剂L-D0PA或促DA释放药 物后，可导致不对称的、能够定量化的异常运动行为。因此，药物诱发的旋转行为的量化是 评价抗PD药物疗效稳定可靠的指标。缺点是该模型仍属急性损伤模型，不能模拟PD慢性 进行性病程特点，不能用于长期神经保护研究中。病理方面也与人类PD有一定差异，如无 细胞内包涵体Lewy小体。而且6-0HDA不能透过血脑屏障，只能通过脑内直接给药才能造 成黑质神经元的损伤。这样，为在灵长类上的应用增加了一定的难度。 鱼藤酮是一种从植物中提取的天然有机杀虫剂，具有高亲脂性，容易透过血脑屏 障，对脑组织线粒体复合酶I具有很强的抑制作用。制备模型的神经毒素来源于自然环境， 其慢性暴露的制作方式能较好地模拟PD发病过程，在病理、生化、发病机制、行为改变等方3面均能较好地模拟人类PD的相关特征。由于产生类似Lewy小体的a -sy皿clein阳性包 涵体，它成为研究Lewy小体形成的分子机制的有效工具。该模型对研究环境因素与PD病 因及发病机制之间的关系具有独特的价值。其慢性、进行性病程特征还特别适合PD的神经 保护治疗研究。缺点是鱼藤酮因为其亲脂性，可以进入所有细胞中，并不选择性的累积在DA 能神经元中。同时，制备过程费时、费力，不同动物个体的制备效果不一 (有些动物无明显 毒性效应)。 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6_四氢吡啶(MPTP)是一种高亲脂性物质，给药后能够迅 速透过血脑屏障并被星形胶质细胞内单胺氧化酶B(MAO-B)转化为1-甲基4-苯基吡啶离 子(MPP+)。而后，特异性的在DA能神经元内浓集。MPTP的毒性效应存在种属差异，人和灵 长类动物最为敏感，猫和小鼠次之，而大鼠、豚鼠对其有明显的抵抗力。这种种属敏感性差 异的原因不明，可能与MPTP进入体内后的分布、代谢及动物体内MA0-B的活性、抗氧化反应 能力的差异等有关。目前，利用MPTP制备的帕金森病模型有①双侧损毁模型成年恒河 猴(猕猴、松鼠猴亦可)，麻醉后，腹腔注射MPTP 2-4mg/Kg，每日一次，共4次，或者按体重 0. 35-0. 5mg/Kg下肢静脉注射MPTP，第1日3次，第2、3日每日2次。在2_4次注射后出现 短暂海洛因样急性反应，表现为仰卧、瞌睡、间歇性闭眼、动作减少、重复点头、四肢伸展、头 向后仰并向一侧旋转。 一周后出现类似于人类的PD症状，如眨眼少、两眼凝视、动作减少、 动作迟缓、肢体发僵、震颤、屈曲姿势、发音、吞咽困难等。②单侧损毁模型恒河猴，按体重 0. 5-0. 7mg/Kg —侧颈动脉注射MPTP，一周后出现损毁对侧肢体活动减少，以及自发性向损 毁侧转身。腹腔注射苯丙胺诱发向损毁侧快速旋转，注射阿朴吗啡后向损毁对侧快速旋转。 提高剂量至0. 8mg/Kg则可制成偏侧为主的双侧PD模型。③MPTP对小鼠有DA能神经毒性， 但所需剂量要比损害猴DA能神经元的剂量高得多。 一般选10-12周龄，体重25-30g成年 C57/BL褐鼠，按体重30-4mg/Kg腹腔注射MPTP， 一天一次，连续7次。于第6_7次注射后出 现暂时性(2-3h)躯干震颤、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍。④成年家猫，按体 重5mg/Kg腹腔注射MPTP，连续5天。于第2次注射后可见短暂海洛因样毒性反应，如瞳孔 散大、流泪、流涎、凝视、活动异常等。在首次注射后次日起逐渐表现出表情呆滞、两眼凝视、 瞬目减少、低头弓背、发音低弱、活动减少、动作笨拙、进食困难等PD症状。此模型行为反应 持续约1-2周，较小鼠PD模型行为反应持续时间长且稳定。MPTP的动物模型不仅有PD症 状，也有DA能神经元选择性损伤的病理改变，因而被广泛用于PD发病机制、诊断及治疗方 面的研究工作中。但是，目前利用MPTP建立的灵长类帕金森病模型，主要以急性模型为主， 并不能模型人类帕金森病的慢性进程。 技术方案 本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷和不足，提供一种帕金森病灵长类动物模型 的建立方法，即用低剂量MPTP建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法，所建立的模型能模 拟人类帕金森病慢性进程。 MPTP诱导的帕金森病已为社会所公认。利用MPTP制备的灵长类PD模型，在症状、 体征、病理、生化改变方面均与人类PD相似，而且较稳定，对抗PD药物的反应(包括副作 用)也同人类相似。利用MPTP诱导出的灵长类PD症状可以用PD患者的量表进行定量研 究。这是目前所建立的最能反映人类PD特征的动物模型。灵长类动物在进化、组织结构、 免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，尤其是在神经系统方面，灵长类动物是许多人类4特有疾病唯一或最合适的实验动物模型。目前的帕金森病动物模型可分为急性和慢性模 型。从最终结果上来看，两种模型均能模拟出人类帕金森病发展到后期的生理、生化改变。 但是，人类的帕金森病是在各种因素作用下逐渐表现出病征的，病程能持续十几年甚至几 十年。因此，要模拟人类帕金森病，慢性模型具有更大的优势。通过低剂量长期给药MPTP 建立的慢性模型可以帮助阐本文档来自技高网...

【技术保护点】
用低剂量ＭＰＴＰ建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法，其特征是按以下步骤进行：（１）、给雄性猕猴肌肉注射ＭＰＴＰ三个月或三个月以上的时间，每隔２～３天注射１次，每次０．２～０．４ｍｇ／ｋｇ，在注射ＭＰＴＰ的期间，对猕猴每隔１～２天做一次行为观察，注射持续到猕猴出现震颤症状为止；（２）、该猕猴在注射ＭＰＴＰ以前进行ＭＲＩ扫描，得到正常期的图谱，对步骤１注射ＭＰＴＰ过程中的猕猴每２０～４０天进行一次ＭＲＩ检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察脑内黑质区的改变进程；（３）、该猕猴在注射ＭＰＴＰ以前进行ＳＰＥＣＴ扫描，得到正常期的图谱，对步骤１注射ＭＰＴＰ过程中的猕猴每２０～４０天进行一次ＳＰＥＣＴ检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察纹状体成像上的改变进程；（４）、注射过ＭＰＴＰ的猕猴，如果：行为观察猴出现震颤，并且在ＭＲＩ成像上观察到脑内黑质区有神经元缺损，同时在ＳＰＥＣＴ成像上显示纹状体有神经元缺损，则表明该猕猴就是成功建立的模型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡新天，马原野，李燕皎，晏婷，牛海晨，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，昆明亚灵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]