本发明专利技术涉及一种帕金森病三维细胞模型的制作方法，其具体步骤如下：(1)细胞制备；(2)模型制作；(3)模型培养；(4)细胞内总乳酸脱氢酶释放；(5)扫描电子显微镜；(6)冰冻切片；(7)HE染色；(8)免疫荧光；(10)mRNA提取；(11)定量PCR。本发明专利技术用SK-N-SH细胞为人源，弥补了动物模型不同种属的缺陷，较传统二维环境更接近人体环境，且选用细胞生长周期快，较利用干细胞的研究能缩短培养时间和降低成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种构建帕金森病三维细胞模型的制作方法，属于模型制造模拟
技术介绍
帕金森病(Parkinson’s disease)，是一种常见的神经系统疾病，帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能的变性死亡，由此而引起纹状体多巴胺含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、氧化应激等均可能参与帕金森病多巴胺能神经元的变性死亡过程。帕金森病作为中枢神经系统退行性病变之一，目前对该疾病的研究，多采用二维细胞模型或者疾病动物模型，但二者都存在着各自的缺陷。前者缺陷在于人们把细胞从整体中分割研究，细胞的形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异。后者主要因为与非同种属性。利用体外三维技术人神经母细胞瘤细胞培养来研究帕金森病，更加接近地模拟人脑组织的在体内的生理环境，这为研究帕金森病的基础研究提供一种新的形式。A three-dimens1nal collagen construct to modellipopolysaccharide-1nduced activat1n of BV2 microglia 一文中运用了 collagen/小胶质细胞混合，制作三维模型，但该文章仅在炎症机制上进行了相关的阐述。已有的将collagen/神经母细胞瘤细胞混合物用于制作三维模型，大多用于材料学方面的研究，而未运用在帕金森病的相关研究中。A three-dimens1nal human neural cell culture modelof Alzheimer’s disease 一文中利用Matrigel胶/神经元干细胞混合，制作三维模型，用于阿尔兹海默病的基础研究，但是干细胞在三维结构中需要各种生长因子诱导，培养周期长。Matrigel胶和生长因子价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建帕金森病三维细胞模型的制作方法，通过体外模拟出了帕金森病的三维细胞模型，该模型更接近于人脑环境，周期更短、材料更实用、价格更低廉。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下。—种帕金森病三维细胞模型的制作方法，其具体步骤如下:(1)细胞制备:采用SK-N-SH神经母细胞瘤细胞进行培养，用含10%胎牛血清、1%的青链霉素的DMEM/F12培养基培养，在37°C、5%二氧化碳、95%空气的条件培养箱中孵育48?96小时，前24?48小时，利用终浓度为10 μ Μ?20 μ Μ全反式维甲酸诱导细胞分化。(2)模型制作:将I型胶原、10*磷酸盐缓冲液、浓度为1Ν的氢氧化钠溶液以及单个细胞悬浮液按照比例配制成混合液，向24孔板中，以每孔加入1ml上述混合液，在37°C、5%二氧化碳、95%空气的条件培养箱中孵育30分钟，混合液凝固成厚度为0.5?1.5_左右的圆盘状模型，将该模型转入6孔板中，并加入4ml DMEM/F12培养基，使模型能够被培养基充分覆盖，并加入终浓度为10 μ Μ?20 μ Μ全反式维甲酸，在37 °C、5 % 二氧化碳、95 %空气的条件培养箱中孵育。(3)模型培养:模型孵育24小时后，换用无FBS培养基，饥饿8?12小时后，加入终浓度为ImM的MPP+溶液，对照组加入同等体积的1*PBS，处理24?72小时。(4)细胞内总乳酸脱氢酶释放:细胞内总乳酸脱氢酶释放:设置背景组、对照组和药物处理组；模型MPP+处理24?72小时后，去除培养基，1*PBS清洗，每孔加入LDH细胞毒性检测试剂盒里的LDH释放剂，倾斜放在孵箱中孵育0.5?1.5小时，使得其与模型充分接触；取上清500 μ l、400g，离心5分钟；配制LDH检测工作液，避光；取离心后上清，每孔120 μ 1加入96孔板中，在相对应的每个孔中加入60 μ 1工作液；混匀，室温，避光摇床上缓慢摇动，孵育30分钟；490nm处测定吸光度，读值应减去背景值；(5)扫描电子显微镜:三维模型药物处理24?72小时后，移除培养基，1*PBS清洗3次，每次10分钟；利用2.5%戊二醛固定，4°C条件下过夜；然后采用生理盐水清洗3次，每次10分钟；利用1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，每道10分钟，叔丁醇浸泡10分钟；临界干燥机干燥后，离子派射仪喷金，进行电镜扫描。(6)冰冻切片:三维模型药物处理24?72小时后，移除培养基，1*PBS清洗3次，每次5?10分钟；利用4%多聚甲醛固定，4°C条件下处理0.5?2小时，利用1*PBS清洗3次，每次5?10分钟；蔗糖溶液4°C条件下过夜脱水，脱水后的三维模型转移至包埋盒中，并合理放置，包埋盒中载有4°C液态冰冻切片包埋剂；将包埋盒放入-80°C冰箱，待凝固成块后送去切片，厚度20?150 μ m ;切片装载在防脱落载玻片上；4% PFA小心滴加在样品上。(7)HE染色:1*PBS浸泡切片，10分钟，重复3次。苏木素10分钟，自来水冲洗，分化液30秒，自来水浸泡15分钟，伊红2分钟，自来水冲洗。常规脱水、透明，中性树脂封片。(8)免疫染色:1*PBS浸泡切片，15分钟，重复3次;1*PBS配制0.1?0.2%曲拉通，透化，1*PBS浸泡切片，10?15分钟，重复3次；1*PBS配制5%?10%牛血清封闭液，封闭30分钟；1*PBS浸泡切片，10?15分钟，重复3次；孵一抗:4°C，湿盒，过夜；1*PBS浸泡切片，10?15分钟，重复3次；孵荧光二抗或HRP?DAB ;蒸馏水冲洗，复染，冲洗，封片。(10)mRNA提取:吸除培养基，每孔1ml Trizol，加入六孔板，将六孔板倾斜静置，10分钟，加入无酶EP管中；三氯甲烷200 μ 1/ml，摇匀，静置5分钟；离心，15分钟，取水相中RNA，另取一组无酶EP管，将水相加入，并取等体积异丙醇，摇匀，_20°C过夜。4°C，12000g，离心20分钟，去除异丙醇，加入75%乙醇，8000g，离心15分钟，去上清，7500g，离心1分钟，待酒精晾干后，加入DEPC水，重悬浮。(11)定量PCR:上述提取得到mRNA逆转录为cDNA，根据Fast Start EssentialDNA Green Master说明书，配制体系；61°C退火；最后根据Ct值，并利用公式2 △△“相对定量计算出SNCA表达情况。该专利技术的有益效果在于:本专利技术用SK-N-SH细胞为人源，弥补了动物模型不同种属的缺陷，较传统二维环境更接近人体环境，且选用细胞生长周期快，较利用干细胞的研究能缩短培养时间和降低成本。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本专利技术。实施例本实施例中的构建帕金森病三维细胞模型的制作方法，其具体步骤如下:(1)细胞制备:本实施例所采用的SK-N-SH神经母细胞瘤细胞采购自中科院上海细胞库。细胞用含10%胎牛血清(FBS)、1%的青链霉素的DMEM/F12培养基培养。37°C,5%二氧化碳，95%空气的条件培养箱中孵育48小时，第一个24小时，终浓度为20 μΜ全反式维甲酸诱导细胞分化。(2)模型制作:将I型胶原、10*磷酸盐缓冲液(PBS)、浓度为1Ν的氢氧化钠(ΝΑ0Η)溶液以及单个细胞悬浮液(最终细胞数大约为1.2*106?本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种帕金森病三维细胞模型的制作方法，其特征在于：该方法的步骤如下：(1)细胞制备：采用SK‑N‑SH神经母细胞瘤细胞进行培养，用含10％胎牛血清、1％的青链霉素的DMEM/F12培养基培养，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育48～96小时，前24～48小时，利用终浓度为10μM～20μM全反式维甲酸诱导细胞分化；(2)模型制作：将I型胶原、10*磷酸盐缓冲液、浓度为1N的氢氧化钠溶液以及单个细胞悬浮液按照比例配制成混合液，向24孔板中，以每孔加入1ml上述混合液，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育30分钟，混合液凝固成厚度为0.5～1.5mm的圆盘状模型，将该模型转入6孔板中，并加入4mlDMEM/F12培养基，使模型能够被培养基充分覆盖，并加入终浓度为10μM～20μM全反式维甲酸，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的条件培养箱中孵育；(3)模型培养：模型孵育24小时后，换用无FBS培养基，饥饿8～12小时后，加入终浓度为1mM的MPP+溶液，对照组加入同等体积的1*PBS，处理24～72小时；(4)细胞内总乳酸脱氢酶释放：细胞内总乳酸脱氢酶释放：设置背景组、对照组和药物处理组；模型MPP+处理24～72小时后，去除培养基，1*PBS清洗，每孔加入LDH细胞毒性检测试剂盒里的LDH释放剂，倾斜放在孵箱中孵育0.5～1.5小时，使得其与模型充分接触；取上清500μl、400g，离心5分钟；配制LDH检测工作液，避光；取离心后上清，每孔120μl加入96孔板中，在相对应的每个孔中加入60μl工作液；混匀，室温，避光摇床上缓慢摇动，孵育30分钟；490nm处测定吸光度，读值应减去背景值；(5)扫描电子显微镜：三维模型药物处理24～72小时后，负压吸引器移除培养基，1*PBS清洗3次，每次10分钟；利用2.5％戊二醛固定，4℃条件下过夜；然后采用生理盐水清洗3次，每次10分钟；利用1％锇酸后固定，梯度酒精脱水，每道10分钟，叔丁醇浸泡10分钟；临界干燥机干燥后，离子溅射仪喷金，进行电镜扫描；(6)冰冻切片：三维模型药物处理24～72小时后，移除培养基，1*PBS清洗3次，每次5～10分钟；利用4％多聚甲醛固定，4℃条件下处理0.5～2小时，利用1*PBS清洗3次，每次5～10分钟；蔗糖溶液脱水，脱水后的三维模型转移至包埋盒中，并合理放置，包埋盒中载有4℃液态冰冻切片包埋剂；将包埋盒放入‑80℃冰箱，待凝固成块后送去切片，厚度20～150μm；切片装载在防脱落载玻片上；4％PFA小心滴加在样品上；(7)HE染色：1*PBS浸泡切片，5～10分钟，重复3次；苏木素5～10分钟，自来水冲洗，分化液30秒，自来水浸泡15分钟，伊红1～2分钟，自来水冲洗；常规脱水、透明，中性树脂封片；(8)免疫染色：1*PBS浸泡切片，15分钟，重复3次；1*PBS配制0.1～0.2％曲拉通，透化，1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；1*PBS配制5％～10％牛血清封闭液，封闭30分钟；1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；孵一抗：4℃，湿盒，过夜；1*PBS浸泡切片，10～15分钟，重复3次；孵荧光二抗或HRP～DAB，蒸馏水冲洗，复染，冲洗，封片；(10)mRNA提取：吸除培养基，每孔1ml Trizol，加入六孔板，将六孔板倾斜静置，10分钟，加入无酶EP管中；三氯甲烷200μl/ml，摇匀，静置5分钟；离心，15分钟，取水相中RNA，另取一组无酶EP管，将水相加入，并取等体积异丙醇，摇匀，‑20℃过夜；4℃，12000g，离心20分钟，去除异丙醇，加入75％乙醇，8000g，离心15分钟，去上清，7500g，离心1分钟，待酒精晾干后，加入DEPC水，重悬浮；(11)定量PCR：上述提取得到mRNA逆转录为cDNA，根据Fast Start Essential DNA Green Master说明书，配制体系；61℃退火；最后根据Ct值，并利用公式2‑ΔΔCt相对定量计算出SNCA表达情况。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祝建洪，林国梁，张雄，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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