CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体。具体提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段。的第二抗体或其抗原结合片段。

【技术实现步骤摘要】
CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及CD70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体。

技术介绍

[0002]近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR
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T)疗法是国内外研究的热点。CAR是一种人为构建的嵌合分子，由抗原识别区、共刺激因子和效应区等几个元件共同组成，修饰表达在免疫细胞后可实现对靶细胞的识别、信号转导和杀伤。CAR
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T疗法是将自体或异体来源的T细胞分离后，经过体外激活和导入编码CAR的基因后，扩增出足够量的CAR
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T细胞再输给肿瘤患者，放大患者体内的免疫细胞抗肿瘤功能。不过，靶向CD19的CAR
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T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤上虽然取得了巨大成功，但也存在肿瘤耐药的局限性。
[0003]在CAR
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T疗法上，多靶向疗法的开发已进行了多种策略的实践，但类似的CAR
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NK细胞疗法未见报道。
[0004]靶向双抗原的策略选择有四种做法，具体包括鸡尾酒疗法(两种CAR
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T细胞序贯或者混合治疗)，两种CAR慢病毒载体共转导制备两种CAR
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T细胞的混合物，基因共表达(Bicistronic)的载体设计可以同时表达两种独立的CAR分子(BiCAR)，以及两个scFv被串联(Tandem)设计成一个CAR分子(TanCAR)。鸡尾酒疗法是最直接的方法，但这种策略需要独立构建达到GMP标准的两种CAR
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T细胞，大幅提高工艺难度和增加成本。而混合不同的CAR慢病毒载体对T细胞进行转导，获得的CAR
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T混合物比例不可控，难以形成同质化的产品标准。BiCAR同时表达两种独立的CAR分子，赋予T细胞经典的“逻辑或”功能，即通过对其中一种抗原的识别即可激活CAR
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T细胞。而TanCAR也可达到这种“逻辑或”的功能，与BiCAR相比，可以大幅减少慢病毒载体的编码量，且表达丰度更为均一。但值得注意的是，TanCAR分子的构建涉及双scFv以及VH和VL的排列组合，还需要考虑抗原表位的时空位置和间距以达到最优的效果。已有研究均凸显了TanCAR的抗原结合区进行优化的重要性。目前尚没有研究揭示scFv和纳米抗体组合的TanCAR优化设计。两者的排列组合也会引起T/NK细胞下游信号转导的差异，从而决定细胞不同的功能输出。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种传统抗体和纳米抗体双靶向的CAR及其免疫细胞疗法。
[0006]本专利技术首先提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段。
[0007]在一个或多个实施方案中，所述第一识别区和第二识别区靶向相同或不同的抗原，例如肿瘤抗原。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述第一识别区是单域抗体VHH。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述第二识别区是第二抗体的scFv。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述第一识别区位于第二抗体或其抗原结合片段的N
端、C端、或VL和VH之间。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：
[0012](1)第二抗体的VL、单域抗体VHH、和第二抗体的VH，
[0013](2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和单域抗体VHH，
[0014](3)单域抗体VHH、第二抗体的VL、和第二抗体的VH。
[0015]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19和/或CD70。
[0016]本专利技术还提供一种CD70结合分子，包含抗CD70单域抗体(VHH)，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
[0017]在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:4所示的VHH的FR区。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条所述VHH的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段。
[0020]在一个或多个实施方案中，所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1
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15个氨基酸组成。
[0021]在一个或多个实施方案中，所述重链抗体的抗原结合片段是VHH。
[0022]在一个或多个实施方案中，所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
[0023]在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子、单域抗体或重链抗体为嵌合抗体或完全人抗体。
[0024]本专利技术还提供一种嵌合抗原受体，其包含任选的信号肽、胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含本文任一实施方案所述的CD70结合分子。
[0025]在一个或多个实施方案中，所述胞外靶标识别区还包含靶向肿瘤抗原的第二抗体或其抗原结合片段。
[0026]在一个或多个实施方案中，所述第二抗体或其抗原结合片段是第二抗体的scFv。
[0027]在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间。
[0028]在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的胞外靶标识别区从N端到C端依次包含：
[0029](1)第二抗体的VL、所述CD70结合分子、和第二抗体的VH，
[0030](2)第二抗体的VL、第二抗体的VH、和所述CD70结合分子，
[0031](3)所述CD70结合分子、第二抗体的VL、和第二抗体的V。
[0032]在一个或多个实施方案中，所述肿瘤抗原是CD19和/或CD70。
[0033]在一个或多个实施方案中，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ ID NO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ ID NO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示。
[0034]在一个或多个实施方案中，所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQ ID NO:13所示。
[0035]在一个或多个实施方案中，嵌合抗原受体的胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
[0036]在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有所述胞外靶标识别区、铰链区、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其包含胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含作为第一识别区的含单域抗体的结合分子和作为第二识别区的第二抗体或其抗原结合片段，所述第一识别区位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一识别区是单域抗体VHH，所述第二识别区是第二抗体的scFv。3.一种CD70结合分子，包含抗CD70单域抗体(VHH)，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，优选地，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:4所示的VHH的FR区，所述单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条所述VHH的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段，或所述CD70结合分子、单域抗体或重链抗体为嵌合抗体或完全人抗体。4.一种嵌合抗原受体，其包含胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内区，所述胞外靶标识别区包含权利要求3所述的CD70结合分子。5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外靶标识别区还包含靶向肿瘤抗原的第二抗体或其抗原结合片段，优选地，所述第二抗体或其抗原结合片段是第二抗体的scFv，和/或所述CD70结合分子位于第二抗体或其抗原结合片段的N端、C端、或VL和VH之间，更优选地，所述第二抗体的LCDR1如SEQ ID NO:6所示，LCDR2如SEQ ID NO:7所示，LCDR3如SEQ ID NO:8所示，HCDR1如SEQ ID NO:9所示，HCDR2如SEQ ID NO:10所示，HCDR3如SEQ ID NO:11所示，所述第二抗体的VL如SEQ ID NO:12所示，VH如SEQ ID NO:13所示。6.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域，优选地，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有所述胞外靶标识别区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，该嵌合抗原受体还在胞外靶标识别区的N端还包含信号肽；优选地，所述信号肽为CD8α信号肽、IL
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2信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第1
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21位氨基酸残基所示，所述铰链区选自CD8α铰链区、CD28铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区和IgG4 Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第399
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443位氨基酸残基所示，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8α跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS
跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选地，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14第444<...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶倩，胡艳平，陈洁，陈杰，
申请(专利权)人：杭州荣谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：