一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物领域，涉及一种抗人肿瘤坏死因子

【技术实现步骤摘要】
一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子
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α
单抗及其用途


[0001]本专利技术属于生物领域，涉及一种抗人肿瘤坏死因子
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α抗体的制备方法和用途。

技术介绍

[0002]自从上世纪末OKT3这种鼠源性单克隆抗体(单抗)制剂被批准用于人体器官移植治疗之后，单克隆抗体药物已成为各国药品生产企业进行新药研究开发的主战场，目前经各国政府主管机构批准上市的单克隆抗体、Fc融合蛋白质药物及其衍生品已接近百种，单克隆抗体药物也从本世纪初的鼠源抗体、嵌合抗体逐渐发展成了包含人源化抗体、人源抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、抗体偶联药物等众多成员的大家庭，这其中以来源于人IgG1 亚类的抗体为主。
[0003]1998年FDA批准抗TNF
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α分子的嵌合体单抗，英夫利西单抗(Infliximab，商品名 Remicade，类克)与甲氨喋呤(MTX)联用治疗对MTX治疗反应不佳的中度至重度的活动性类风湿关节炎病人，可减轻体征和症状，抑制结构损伤恶化和改善体力功能。Remicade 还适用于治疗对常规治疗反应不佳的中度至重度的活动性克罗恩氏(Crohn)病，减轻体征和症状并且引起和维持临床的改善。以及治疗瘘管性克罗恩氏病，减少肠
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皮肤和直肠
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阴道瘘管有分泌物瘘管数，并且保持瘘管闭合。2004年12月FDA批准其治疗活动性强直性脊柱炎(AS)减轻体征和症状。2005年8月批准治疗银屑病关节炎减轻活动性关节炎的体征和症状。2005年9月批准治疗对常规治疗反应不佳的中度至重度的结肠炎，减轻体征和症状，达到临床缓解和粘膜愈合，以及取消皮质激素的使用。2006年5月17日中国SFDA批准类克在中国上市。
[0004]2002年12月31日和2003年9月8日美国FDA和欧洲共同体先后批准雅培(Abbott) 公司的第一个人单抗Adalimumab(阿达木单抗，商品名Humira，中文译名：修美乐)上市。治疗对一种以上DMARDs反应不佳的成人中度及重度严重活动性类风湿关节炎病人，减轻病人的体征和症状及抑制关节结构损伤的恶化进展。Humira可单独使用或与MTX或其它 DMARDs合用。2005年10月批准治疗患银屑病关节炎的病人，以减轻活动性关节炎的体征和症状。阿达木单抗是首个来源于人源噬箘体库技术获得抗TNF
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α单抗，其恒定区部分来源于人IgG1。
[0005]IgG1是人体血清中含量最高的一种抗体，也是人体内发挥免疫作用的最重要的抗体类型。抗体的糖基化是抗体发挥生物功能不可缺少的，不同来源的细胞其表达的重组蛋白质的糖基化的类型也不相同，不同的培养条件也会明显的影响抗体的糖基化类型。
[0006]人血清IgG的N
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糖基化位点位于Fc片段CH2区的通用序列(Asn297
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X
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Ser/Thr,X 是除脯氨酸的任意氨基酸残基),糖基通过酰胺键与抗体共价结合。抗体的糖基化通常为复杂的双天线糖型,有的还可能具有分支N
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乙酰葡糖胺结构。经典的单抗通常由两条重链和两条轻链组成,一般在两条重链的297位或邻近的谷氨酰胺残基上具有N
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糖修饰,通过酰胺键与N
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糖的非还原端N
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乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)连接。两个N
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乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖(Man)组成N
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糖的核心五糖结构,其还原端若再加和两个N
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乙酰葡萄糖胺则为G0；G0 基础上非还原端加和一个半乳糖(Gal)则为G1,G1有两种异构体,分别为α
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1,6臂和α
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1,3
‑ꢀ
臂,
若加和两个半乳糖则为G2；若加和核心岩藻糖(Fuc)则分别为G0F、G1F、G2F。半乳糖非还原端还可加和唾液酸(Sia)或者半乳糖,其中唾液酸可分为乙酰神经氨酸 (N
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acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和羟乙酰神经氨酸(N
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glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)两种,半乳糖则通过α
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1,3键连接,此末端半乳糖简称为α半乳糖(α
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gal)。N
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糖的复杂型结构如下所示。此外还有高甘露糖型和杂合型结构。
[0007][0008]Fc上N
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糖末端可能包含0、1或2个末端Gal残基(G0、G1或G2),末端Gal含量通过增加抗体和C1q的结合力增加CDC效应,但不影响抗体和FcγRIIIa的结合,所以对 ADCC活性没有影响。Gramer等[Biotechnol Bioeng,2011,108:1591
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1602]通过流加培养方式对GS
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CHO进行发酵,通过调节尿嘧啶、氯化锰和半乳糖的浓度,可使单抗的半乳糖末端水平明显升高。另外Fc上含高甘露糖型N
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糖单抗的CDC效应也减弱,其机制可能为高甘露糖型N
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糖末端不含半乳糖[Zhou Q,Shankara S,Roy A,et al.Biotechnol Bioeng,2008,99: 652
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665]。近些年来也有文献报道高唾液酸修饰的糖基可通过影响抗体空间构象而延长半衰期。
[0009]甘露糖受体可结合糖蛋白末端的甘露糖,结合后可通过内吞作用介导糖蛋白的降解而降低糖蛋白的半衰期。有文献[Goetze AM,Liu YD,Zhang Z,etal.Glycobiology,2011,21:949
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959.Alessandri L,Ouellette D,Acquah A,et al.MAbs,2012, 4:509
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52026]证明含高甘露糖型的N
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糖单抗的半衰期明显缩短,但是同时有文献[Chen X, Liu YD,Flynn GC,et al.Glycobiology,2009,19:240
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249]证明高甘露糖型N
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糖由于被血清中的甘露糖酶降解,所幸的是高甘露糖型单抗占比较少，因此一般情况下，它并不是单抗半衰期缩短的主要原因。虽然已发表的文献中有矛盾的表述,但是主流观点仍然是高甘露糖型可缩短单抗的半衰期或具有稍强的免疫原性,所以在制造人用单克隆抗体药物的过程中应注意对单抗高甘露糖型比例的控制，毕竟高甘露糖型的单抗不是大家所喜好的类型。
[0010]高甘露糖型对Fc聚糖的异质性程度影响较为显著，常见的末端甘露糖基团包括 Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2。研究表明高甘露糖型的单抗分子与C1q的亲和力较低，其CDC活性也较低[Kanda Y,Yamada T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子
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α单抗，其特征在于，由含214氨基酸的轻链和451氨基酸的重链构成，该抗体结构如下：轻链氨基酸的序列为：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC重链氨基酸的序列为：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔健，彭玲，孔茜，张凯丽，
申请(专利权)人：北京绿竹生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：