一种基于新型SMA膜蛋白稳定策略结合BLI的BCRP蛋白调节剂筛选方法及应用技术

本发明专利技术涉及药物筛选领域，具体是一种基于新型苯乙烯马来酸聚合物(SMA)膜蛋白稳定结合生物膜干涉(BLI)技术的乳腺癌耐药蛋白(BCRP)调节剂筛选方法，及从中药中筛选BCRP蛋白调节剂的应用。本发明专利技术具有高效、专属、经济、便捷、快速等优点。本发明专利技术能显著提高BCRP蛋白调节剂评价或筛选效率，对潜在BCRP抑制剂的筛选以及进一步的临床应用等具有重要意义。一步的临床应用等具有重要意义。一步的临床应用等具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于新型SMA膜蛋白稳定策略结合BLI的BCRP蛋白调节剂筛选方法及应用


[0001]本专利技术涉及药物筛选领域，具体地说，是一种快速、高效的基于新型SMA膜蛋白稳定策略结合BLI的乳腺癌耐药蛋白(BCRP)调节剂的筛选方法，及从中药中筛选活性化合物的应用。

技术介绍

[0002]肿瘤多药耐药(Multidrug resistance，MDR)是指在肿瘤细胞接触一种抗癌药后产生耐药，并继而对其他结构以及作用机制各异的抗癌药物产生耐药的现象。肿瘤多药耐药的产生严重影响了化疗药物对肿瘤治疗效果。乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein，BCRP)是重要的ATP结合盒外排转运蛋白，在肿瘤细胞中高表达，并且具有广泛的底物谱，使得BCRP成为肿瘤细胞发生耐药性及发生药物相互作用的重要机制之一。目前，将具有抑制BCRP蛋白活性的化合物作为抗癌药物的化学增敏剂是逆转MDR的热点，开发适合的BCRP蛋白调节剂，对于临床逆转肿瘤多药耐药、新药开发中提高药物生物利用度和改善药物处置等方面有重要意义。
[0003]目前筛选BCRP抑制剂的体外方法包括ATP酶活性测定法，双向转运实验与计算机模拟筛选技术。双向转运实验是体外鉴定P
‑
gp和BCRP底物的黄金标准。双向转运实验常用的细胞系为Caco
‑
2细胞株，以带有荧光的BCRP底物
‑
Hoechst 33342为检测目标，当Hoechst 33342与潜在BCRP抑制剂共同使用时，根据Hoechst 33342在细胞内累积量的变化来验证该化合物对BCRP的抑制作用，但该方法无法测定小分子与BCRP蛋白的亲和力参数，并且Caco
‑
2细胞中同时表达的其他转运蛋白降低了该方法的专属性。ATP酶活试剂盒可以测定多种转运蛋白调节剂的活性，提供小分子化合物和转运蛋白亲和力的信息，但该方法假阳性率较高且无法提供转运速率等参数。而计算机模拟的假阳性结果较高，仍需要细胞实验进行补充验证化合物的活性。此外，上述方法还存在耗时、通量较低和特异性差等问题。因此，建立更加快速、专属的BCRP蛋白抑制剂筛选新方法，对于高效低毒的BCRP新型抑制剂的发现、以及进一步的逆转肿瘤MDR临床研究具有重要意义。
[0004]苯乙烯马来酸聚合物(Styrene Maleic Acid，SMA)是苯乙烯和马来酸酐通过自由基聚合得到一种性能优良的共聚物。与传统的膜蛋白稳定剂相比，该聚合物可以直接从细胞膜中提取膜蛋白，无需去污剂增溶步骤，使得膜蛋白可以保持在内源性脂质环境当中，最大程度保证膜蛋白的结构和功能完整。因此，SMA可以很好地解决BCRP蛋白因双亲性而导致的体外易聚集失活问题，有望应用于BCRP蛋白的稳定提取。
[0005]生物膜干涉技术(Biolayer interferometry，BLI)是一种通过检测干涉光谱的位移变化来表征传感器表面结合情况的技术。BLI的技术特征在于其一次性的生物传感器，传感器尖端固化有一层特殊的识别分子，该识别分子可以结合并筛选待分析物中的相应活性物质，当结合到传感器表面的分子数量发生增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移变化，而这种位移变化直接反应出传感器表面生物膜的厚度，从而表征生物分子间的结
合情况。BLI技术的优势在于其浸渍性生物传感器的简单性，浸入即读，生物传感器直接浸入样品孔读取数据，因此被测样品无需预处理，缓冲体系也无严苛的要求，更适用于中药提取液这种复杂体系的分析。此外BLI还有无需标记、所需样品少、实时监测、分析灵敏度高等优点。基于上述原理与优势，BLI技术可作为很好地蛋白与小分子互作分析手段，用于中药复杂体系BCRP调节剂的筛选。
[0006]目前直接针对于BCRP蛋白本身，从而评价化合物与BCRP蛋白结合能力，且能准确给出结合参数的分析方法，用于快速高效筛选BCRP蛋白抑制剂的方法研究尚处于空白。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供新型苯乙烯马来酸聚合物(SMA)膜蛋白稳定技术与生物膜干涉(BLI)技术结合，用超级链霉亲和素(SSA)生物传感器作为实验探针，通过生物素
‑
亲和素共价结合的方式构建的活性蛋白探针，以及利用该蛋白探针进行快速、高效筛选与评价乳腺癌耐药蛋白(BCRP)调节剂的方法的建立与应用。
[0008]本专利技术的第一方面，提供一种基于新型苯乙烯马来酸聚合物(SMA)膜蛋白稳定结合生物膜干涉(BLI)技术的BCRP蛋白调节剂筛选方法，包括以下步骤：
[0009](a)SMA
‑
BCRP蛋白脂质体的构建；首先用新型的聚合物膜蛋白稳定材料SMA从LLC
‑
PK1/BCRP细胞中萃取出BCRP蛋白，构建SMA
‑
BCRP蛋白脂质体并验证BCRP蛋白活性；
[0010]进一步的，用SMA分别萃取LLC
‑
PK1和LLC
‑
PK1/BCRP细胞膜，构建SMA
‑
BCRP和SMA
‑
PK1蛋白脂质体，其中SMA
‑
BCRP为阳性脂质体，SMA
‑
PK1为阴性对照脂质体；
[0011](b)SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针的构建；将生物素化后的SMA
‑
BCRP蛋白脂质体固化在SSA探针上，构建SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针，平衡时间60
‑
300s，固化时间60
‑
300s，转速1000
‑
3000rpm/min；SSA
‑
SMA
‑
BCRP作为检测探针，SSA
‑
SMA
‑
PK1作为参比探针；
[0012](c)活性化合物的筛选；所构建的SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针应用于从中药中筛选潜在的BCRP蛋白调节剂，并进行结构确证。
[0013]进一步的，步骤(a)所述的SMA
‑
BCRP蛋白脂质体的构建，包括以下步骤：
[0014](a1)细胞膜的提取；
[0015]采用超声破碎，差速离心的方式提取；优选地，超声600W，7min，每次2秒，间隔10秒。
[0016](a2)SMA萃取BCRP蛋白；
[0017]将一定比例体积的SMA溶液和细胞膜混悬液混合，置于4℃摇床孵育，高速离心收集上清得到SMA
‑
BCRP脂质体。
[0018]进一步的，所述的SMA溶液浓度1％
‑
2.5％，细胞膜混悬液浓度20mg/mL
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SMA膜蛋白稳定结合BLI的BCRP蛋白调节剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)SMA
‑
BCRP蛋白脂质体的构建；首先用SMA从LLC
‑
PK1/BCRP细胞中萃取出BCRP蛋白，构建SMA
‑
BCRP蛋白脂质体并验证BCRP蛋白活性；(b)SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针的构建；将生物素化后的SMA
‑
BCRP蛋白脂质体固化在SSA探针上，构建SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针，平衡时间60
‑
300s，固化时间60
‑
300s，转速1000
‑
3000rpm/min；SSA
‑
SMA
‑
BCRP作为检测探针，SSA
‑
SMA
‑
PK1作为参比探针；(c)活性化合物的筛选；所构建的SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针应用于从中药中筛选潜在的BCRP蛋白调节剂，并进行结构确证。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)所述的SMA
‑
BCRP蛋白脂质体的构建，包括以下步骤：(a1)细胞膜的提取；采用超声破碎，差速离心的方式提取；(a2)SMA萃取BCRP蛋白；将SMA溶液和细胞膜混悬液混合，置于4℃摇床孵育，高速离心收集上清得到SMA
‑
BCRP脂质体；所述的SMA溶液浓度1％
‑
2.5％，细胞膜混悬液浓度20mg/mL
‑
160mg/mL，孵育时间1h
‑
12h；(a3)ATP酶活性测定；ATP酶活性测定分组为A:细胞膜
‑
空白组；B:细胞膜
‑
背景组；C:细胞膜
‑
阳性对照组；D:SMA
‑
BCRP
‑
空白组；E:SMA
‑
BCRP
‑
实验组；F:SMA
‑
BCRP
‑
阳性对照组；A
‑
C组用以确定该检测系统的适用性，系统适用性达到要求后测定BCRP蛋白的活性；在确定该检测系统工作良好的前提下，D
‑
E组的RLU发光行为应与A
‑
C组一致，表明SMA
‑
BCRP中的BCRP蛋白活性良好。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(b)所述的SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针的构建，包括以下步骤：(b1)SMA
‑
BCRP蛋白脂质体生物素化；使用生物素快速试剂盒将SMA
‑
BCRP和SMA
‑
PK1蛋白脂质体生物素化；(b2)蛋白探针活性考察；将生物素化后的SMA
‑
BCRP和SMA
‑
PK1蛋白脂质体分别固化在不同的SSA探针上，构建SSA
‑
Biotin
‑
SMA
‑
BCRP蛋白探针，SSA
‑
SMA
‑
BCRP作为检测探针，SSA
‑
SM...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪战英，方家豪，乐健，王辉，沈淑琦，晁亮，何宇臻，陈兰，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：