一种生物法转化生产L-羟脯氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，且公开了一种生物法转化生产L

【技术实现步骤摘要】
一种生物法转化生产L
‑
羟脯氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为一种生物法转化生产L
‑
羟脯氨酸的方法。

技术介绍

[0002]我国L
‑
羟脯氨酸的生产采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程，收率仅为5％，存在原料消耗量大、“三废”排放量大、能耗高和生产成本高等问题。该工艺采用动物源原料，生产过程中用到亚硝酸氧化工艺，微量的残存物或杂质会对后续衍生化后的中间体或原料药产生潜在的危害。国外制药公司已经提出了对于L
‑
羟脯氨酸的生物源来源要求，希望限制动物源L
‑
羟脯氨酸的使用。国内所有采用化学水解工艺生产的企业均无法实现“三废”的达标排放，属于重度污染工艺，面临着随时关停的窘境。急需研发一种清洁化和能耗低的工艺，而生物催化转化法可以替代传统的化学提取工艺，得到高纯度的L
‑
羟脯氨酸产品，可以实现规模化生产。

技术实现思路

[0003](一)解决的技术问题
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种生物法转化生产L
‑
羟脯氨酸的方法，提高了L
‑
羟脯氨酸的转化率。
[0005](二)技术方案
[0006]一种生物法转化生产L
‑
羟脯氨酸的方法，所述生产L
‑
羟脯氨酸的L
‑
脯氨酸羟化酶基因来自指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)；所述可表达目的基因的工程菌BL21
‑
CodonPlus(DE3)菌种培养和酶源发酵制备及包埋固定化；所述L
‑
羟脯氨酸由固定化细胞对转化液催化转化而成。
[0007]优选的，所述工程菌构建步骤如下：
[0008](1)根据NCBI数据库中公开的来自Dactylosporangium sp.RH1的L
‑
脯氨酸羟化酶的基因phy
‑
1序列信息；
[0009](2)依据大肠杆菌的密码子频率进行调整，降低整个DNA序列的GC含量，获得优化后的L
‑
脯氨酸羟化酶的基因(phy
‑
2)；
[0010](3)将Dactylosporangium sp.RH1的L
‑
脯氨酸羟化酶基因phy
‑
1及优化后的基因phy
‑
2分别与表达载体pET
‑
M
‑
3C连接，构建L
‑
脯氨酸羟化酶的表达载体；再将上述表达载体转化可表达目的基因的工程菌BL21
‑
CodonPlus(DE3)中得到菌种。
[0011]优选的，所述菌种培养包括：
[0012](1)培养基：葡萄糖作为碳源，酵母膏、蛋白胨和硫酸铵作为氮源，选择K2HPO4、KH2PO4、Mg2SO4、FeSO4四种无机盐；
[0013](2)胁迫菌种上罐：菌液稀释倍数：10
‑5～10
‑8；处理温度：45～60℃；处理时间：4～7min；
[0014](3)培养温度：28～30℃；培养周期10～16h；
[0015]培养过程中，取样检查菌丝形态、pH值、透光率。
[0016]优选的，所述培养基最佳配方为：葡萄糖2％、酵母浸粉0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.02％、硫酸亚铁0.01％、pH6.8～7.2。
[0017]优选的，所述酶源发酵包括：
[0018](1)菌体培养：空气流量：1:0.5～1.5；转速200～600rpm；溶氧率：10～40％；流加氨水、培养基、70％葡萄糖、抗性等；
[0019](2)诱导工艺：诱导剂：乳糖；诱导剂浓度：0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％；诱导剂加入时间：0h、2h、4h 6h、8h、10h；诱导时间：5h、7h、9h、11h、13h、15h；
[0020](3)转化液：200mM L
‑
脯氨酸、200mMα
‑
酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mM L
‑
抗坏血酸、80mM pH 6.5MES缓冲液及1％ CCTC；所述CCTC浓度：20、24、28、32、37mg/L。
[0021]优选的，所述诱导剂浓度：0.8％；诱导剂加入时间：接种后直接加入乳糖；乳糖诱导时间：11h；CCTC浓度：25mg/L。
[0022]优选的，所述包埋固定化方式：
[0023](1)酶的固定化试验：海藻酸钠固定化酶、大孔树脂D201GF固定化酶、大孔树脂D301R固定化酶；
[0024](2)含酶的全细胞固定化试验：海藻酸钠包埋细胞。
[0025]优选的，所述固定化酶的酶活收率：海藻酸钠固定化酶：87.1％，大孔树脂D201GF固定化酶83.6％，大孔树脂D301R固定化酶：77.4％，海藻酸钠包埋细胞：87.9％；所述固定化菌体细胞使用频次：固定化羟化酶重复使用五次后转化率降到71％以下，固定化细胞转化率重复使用五次后在92％以上。
[0026]优选的，所述选择固定化细胞使用。
[0027]优选的，所述转化反应为：
[0028](1)转化工艺：利用中试罐转化，采用底物L
‑
脯氨酸和α
‑
酮戊二酸的流加来调节体系的pH，去掉MES和Tris；
[0029](2)转化液预处理：转化结束后抽滤收集清液，用浓硫酸调pH 3.0～3.2,加热到95℃以上，离心心除去除杂蛋白收集上清液，一次减压浓缩5
‑
6倍，活性碳脱色，加入等体积乙醇二次除蛋白，二次减压蒸发浓缩，加入乙醇结晶，干燥，成品；
[0030](3)液相色谱外标法检测含量：98.0％以上为合格品。
[0031](三)有益的技术效果
[0032]单一的葡萄糖做碳源，硫酸铵做氮源，加入少量酵母粉，磷酸二氢钾等微量元素制备而成的培养基，增加了酶的含量，由原来的1％增加到2％。基因工程菌扩培上罐采用胁迫上罐，菌液稀释倍数为10
‑5～10
‑8，处理温度为45～60℃，处理时间为4～7min，使得基因工程菌中试实验成功实现。菌体培养在线流加氨水、70％葡萄糖，补加培养基和抗性，菌量由2％提高到5％，最高可达6％。诱导剂选择乳糖，浓度选择0.8％，接种后直接加入，诱导时间为11h，乳糖既是碳源又是诱导剂，诱导在葡萄糖消耗完开始，使得葡萄糖流加工艺得以实现，转化率最高，且控制成本，工艺简单。表面活性剂采用CCTC，相比SDS没有起泡作用，破壁效果更稳定。固定化酶和固定化细胞使用五次后转化率分别为71％以下和92％以上，制备固定化细胞损失少、分离简单、重复利用次数多、反应条件温和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物法转化生产L
‑
羟脯氨酸的方法，其特征在于：所述生产L
‑
羟脯氨酸的L
‑
脯氨酸羟化酶基因来自指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)；所述可表达目的基因的工程菌BL21
‑
CodonPlus(DE3)菌种培养和酶源发酵制备及包埋固定化；所述L
‑
羟脯氨酸由固定化细胞对转化液催化转化而成。2.根据权利要求1所述的生产L
‑
羟脯氨酸的L
‑
脯氨酸羟化酶基因来自指孢囊菌，其特征在于：所述工程菌构建步骤如下：(1)根据NCBI数据库中公开的来自Dactylosporangium sp.RH1的L
‑
脯氨酸羟化酶的基因phy
‑
1序列信息；(2)依据大肠杆菌的密码子频率进行调整，降低整个DNA序列的GC含量，获得优化后的L
‑
脯氨酸羟化酶的基因(phy
‑
2)；(3)将Dactylosporangium sp.RH1的L
‑
脯氨酸羟化酶基因phy
‑
1及优化后的基因phy
‑
2分别与表达载体pET
‑
M
‑
3C连接，构建L
‑
脯氨酸羟化酶的表达载体；再将上述表达载体转化可表达目的基因的工程菌BL21
‑
CodonPlus(DE3)中得到菌种。3.根据权利要求1所述的可表达目的基因的工程菌菌种培养和酶源发酵制备及包埋固定化，其特征在于：所述菌种培养包括：(1)培养基：葡萄糖作为碳源，酵母膏、蛋白胨和硫酸铵作为氮源，选择K2HPO4、KH2PO4、Mg2SO4、FeSO4四种无机盐；(2)胁迫菌种上罐：菌液稀释倍数：10
‑5～10
‑8；处理温度：45～60℃；处理时间：4～7min；(3)培养温度：28～30℃；培养周期10～16h；培养过程中，取样检查菌丝形态、pH值、透光率。4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述培养基最佳配方为：葡萄糖2％、酵母浸粉0.5％、硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.02％、硫酸亚铁0.01％、pH 6.8～7.2。5.根据权利要求1所述的可表达目的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：田朝勃，李巧丽，张梦娇，庞义更，巴红娟，
申请(专利权)人：石家庄市冀荣药业有限公司，
类型：发明
国别省市：