尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法技术

本发明专利技术提供尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法，包括(1)取尿样加入甲酸

【技术实现步骤摘要】
尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法


[0001]本专利技术涉及检测分析
，具体涉及尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法。

技术介绍

[0002]真菌毒素是某些产毒真菌在特定条件下产生的一类化学结构各异的有毒次级代谢产物的总称。目前，结构已知的真菌毒素有400余种，常见的有黄曲霉毒素(aflatoxins，AFBs)、赭曲霉毒素(ochratoxins，OTs)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和交链孢毒素(Alternaria toxins)等
[1]。因此，通过测定食品和/或谷物或饲料中多种真菌毒素的含量来评估其对人体健康的暴露风险是目前常用的方法。如静平等、肖凯军等、范志辰等分别建立了一种同时检测粮谷中21种真菌毒素的方法或同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法或同时检测水果中真菌毒素和农药多残留的方法。
[0003]此外，大量研究证实，DON和交链孢毒素等多种毒素会在植物生长代谢过程及谷物或饲料加工过程中与基质成分结合生成隐蔽型真菌毒素(masked mycotoxins)。该类毒素通常难以通过常规的方法从谷物或饲料等基质中提取出来和/或在净化过程中丢失，导致不能通过常规的分析方法检测到，但却可在人和动物摄入后在肠道中水解成毒素源，并进一步转变成毒素单体而发挥毒性作用。
[0004]上述传统的针对谷物或饲料中真菌毒素的提取检测方法仅能反映毒素通过膳食摄入的情况，并不能全面反映毒素在人体内的整体暴露情况，如经皮肤、生活和职业环境的吸入等引起的暴露情况，以及隐蔽型毒素的暴露风险，因此，基于有毒物质的体内代谢转化过程而建立的生物监测方法逐渐受到重视。相对于血液、组织等有创生物样品，尿液作为人体外周循环、无需专业手段即可获得的生物样本，成为近年来生物监测的首选样本，已被成功用于DON、AFs等真菌毒素的检测与暴露风险评估。
[0005]另外，鉴于真菌毒素的低水平污染的特性，合适的前处理技术也是检测方法的关键指标之一。现有方法大多采用免疫亲和柱(Immunoaffinity column，IAC)、固相萃取(Solid phase extraction，SPE)或“dilute and shoot”等方法进行，前两者的净化成本高，一般需要活化、上样吸附、淋洗、解吸附/洗脱等步骤，操作流程复杂。后者虽然是直接提取后上样，但考虑到生物样品中多含有尿素、糖类、蛋白质、磷脂及无机盐等多种体内代谢物，因此具有难以将毒素外的上述杂质去除干净。
[0006]因此，仍亟需一种检测成本合适、操作便捷而又能全面评估常见真菌毒素的体内暴露风险的测定方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法，该测定方法采用反相固相萃取吸附剂的净化处理方法，并且结合了可同时对多种毒素进行测定的液相色谱串联质谱，实现了对人体尿液中28种常见真菌毒素及其代谢物的协同测定，避免了
仅检测一种或几种结构类似的真菌毒素而造成检测成本高、费时费力，而又不能全面评估常见真菌毒素的体内暴露风险的缺陷。
[0008]为达到上述技术效果，本专利技术技术方案的基本构思如下：
[0009]一种尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法，包括如下步骤：
[0010](1)尿样的前处理
[0011]取尿样加入甲酸
‑
乙腈提取液中，涡旋、振荡、离心，收集得到上清液A；取等量的尿样加入甲酸
‑
乙腈提取液，加入葡萄糖醛苷酶，于37℃水浴过夜，涡旋后振荡、离心，收集得到上清液B；将上清液A和上清液B分别过未经活化的Prime HLB柱，用乙腈洗脱，分别收集洗脱液、氮吹，吹干后分别用甲醇水溶液复溶，上超高效液相色谱
‑
串联质谱仪测定；
[0012](2)标准溶液的配制
[0013]以甲醇为溶剂分别配制28种真菌毒素的标准储备液，临用时用甲醇稀释标准储备溶液，配制成不同浓度的标准溶液；
[0014]以甲醇为溶剂配制18种稳定同位素混合内标溶液，于
‑
20℃保存；
[0015](3)样品测定
[0016]按照上述步骤(1)中尿样的前处理过程处理样品，然后采用超高效液相色谱串联质谱仪分别检测得到真菌毒素及其稳定同位素内标的色谱图和峰面积；
[0017](4)定量分析
[0018]采用稳定同位素内标稀释法对测定真菌毒素的含量进行分析；以标准物质的浓度为横坐标，以对应的标准物质与内标物质的质谱定量离子峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0019]作为一种方式，所述步骤(3)中，超高效液相色谱串联质谱仪采用的色谱柱为C
18
柱，柱温为40℃，进样室温度为10℃，进样量为5μL，流速为0.3mL/min，洗脱方式为梯度洗脱。
[0020]作为一种方式，将28种真菌毒素按照理化特性分为两组，第一组含18种真菌毒素和10种稳定同位素内标物质，18种真菌毒素为FB1、FB2、FB3、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、DON、3
‑
Ac
‑
DON、15
‑
Ac
‑
DON、OTA、OTB、OTC、HT
‑
2、T
‑
2、ST和CPA，10种内标物质分别为
13
C
15
‑
DON、
13
C
17
‑3‑
Ac
‑
DON、
13
C
17
‑
AFM1、
13
C
17
‑
AFG2、
13
C
34
‑
FB1、
13
C
17
‑
AFG1、
13
C
17
‑
AFB2、
13
C
17
‑
AFB1、
13
C
34
‑
FB2、
13
C
20
‑
OTA；采用的流动相A相为0.1％甲酸水(v/v)溶液、B相为乙腈，梯度洗脱程序
‑
流动相A：0.1％甲酸水(v/v)溶液；B：乙腈梯度洗脱程序：0
‑
1min，90％A(v/v)，10％B(v/v)；1
‑
8min，90％
‑
5％A(v/v)，10％
‑
95％B(v/v)；8
‑
12min，5％A(v/v)，95％B(v/v)；12.0
‑
12.1min，5％
‑
90％A(v/v)，95％
‑
10％B(v/v)；12.1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.尿液中常见真菌毒素及其代谢物的靶向定量测定方法，包括如下步骤：(1)尿样的前处理取尿样加入甲酸
‑
乙腈提取液中，涡旋、振荡、离心，收集得到上清液A；取等量的尿样加入甲酸
‑
乙腈提取液，加入葡萄糖醛苷酶，于37℃水浴过夜，涡旋后振荡、离心，收集得到上清液B；将上清液A和上清液B分别过未经活化的Prime HLB柱，用乙腈洗脱，分别收集洗脱液、氮吹，吹干后分别用甲醇水溶液复溶，上超高效液相色谱
‑
串联质谱仪测定；(2)标准溶液的配制以甲醇为溶剂分别配制28种真菌毒素的标准储备液，临用时用甲醇稀释标准储备溶液，配制成不同浓度的标准溶液；以甲醇为溶剂配制18种稳定同位素混合内标溶液，于
‑
20℃保存；(3)样品测定按照上述步骤(1)中尿样的前处理过程处理样品，然后采用超高效液相色谱串联质谱仪分别检测得到真菌毒素及其稳定同位素内标的色谱图和峰面积；(4)定量分析采用稳定同位素内标稀释法对待测样品中真菌毒素的含量进行分析；以标准物质的浓度为横坐标，以对应的标准物质与内标物质的质谱定量离子峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述的靶向定量测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，超高效液相色谱串联质谱仪采用的色谱柱为C
18
柱，柱温为40℃，进样室温度为10℃，进样量为5μL，流速为0.3mL/min，洗脱方式为梯度洗脱。3.根据权利要求2所述的靶向定量测定方法，其特征在于，将28种真菌毒素按照理化特性分为两组，第一组含18种真菌毒素和10种稳定同位素内标物质，18种真菌毒素为FB1、FB2、FB3、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、DON、3
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Ac
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DON、15
‑
Ac
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DON、OTA、OTB、OTC、HT
‑
2、T
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2、ST和CPA，10种内标物质分别为
13
C
15
‑
DON、
13
C
17
‑3‑
Ac
‑
DON、
13
C
17
‑
AFM1、
13
C
17
‑
AFG2、
13
C
34
‑
FB1、
13
C
17
‑
AFG1、
13
C
17
‑
AFB2、
13
C
17
‑
AFB1、
13
C
34
‑
FB2、
13
C
20
‑
OTA；采用的流动相A相为体积分数0.1％甲酸水溶液、B相为乙腈，梯度洗脱程序
‑
流动相A：体积分数0.1％甲酸水溶液；B：乙腈梯度洗脱程序：以流动相的体积分数计，0
‑
1min，90％A，10％B；1
‑
8min，90％
‑
5％A，10％
‑
95％B；8
‑
12min，5％A，95％B；12.0
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12.1min，5％
‑
90％A，95％
‑
10％B；12.1
‑
16min，90％A，10％B；第二组含10种真菌毒素和8种稳定同位素内标物质，10种真菌毒素为TeA、AOH、AME、ALT、TEN、ENA、ENA1、ENB、ENB1、BEA，8种内标物质分别为
13
C
10
‑
TEA、
13
C
15
‑
ALT、
13
C
14
‑
AOH、

【专利技术属性】
技术研发人员：王硕，韩小敏，孙灵利，吴兴海，孙秀兰，徐文静，叶永丽，纪剑，孙嘉笛，李孟寒，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心江南大学，
类型：发明
国别省市：