一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法。包括：将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力；所述双荧光素酶报告质粒包括recA基因的启动子。本发明专利技术将recA基因的启动子整合至双荧光素酶报告质粒中，导入微生物中得到一种双荧光素酶报告系统，该报告系统的荧光信号变化和Stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，可以准确指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。指示化合物对于Stx2噬菌体激活的抑制能力。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法。

技术介绍

[0002]随着畜禽养殖业的快速、规模化发展，病原菌感染给养殖业发展造成的经济损失也日益上升。大肠杆菌是造成仔猪腹泻和死亡的重要病原菌之一，其致病能力与其毒力因子密切相关，如志贺毒素等。目前抗生素是常用于解决问题的手段之一，但是养猪生产中大量使用抗生素促进了细菌耐药性的增强以及毒力因子的传播，严重威胁仔猪肠道健康。
[0003]近年来，开发利用抗生素替代品成为行业研究的热点、焦点和难点。噬菌体是一种能够侵染细菌的微生物，对畜禽感染的致病菌具有杀灭作用，具有靶向性强、安全性高、无药残、杀菌更彻底和绿色环保的特点，可作为有效的抗生素替代品之一。但是噬菌体作为抗生素替代品的研究仍处于研究阶段，部分噬菌体本身可能会生产不利于动物养殖的毒素。
[0004]产志贺毒素大肠杆菌的致病性主要与其产生的2型志贺毒素(Stx2)有关。编码Stx2的基因位于大肠杆菌Stx2原噬菌体基因组中。Stx2原噬菌体的激活导致编码Stx2基因的表达和Stx2的形成与释放。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种筛选抑制微生物生产Stx2能力的化合物的方法。基于recA基因的启动子构建双荧光素酶报告质粒，将其转导入微生物得到一种双荧光素酶报告系统，其可以准确筛选出对于stx2噬菌体激活有抑制效果的化合物。
[0006]第一方面，本专利技术提供一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法，包括：
[0007]将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；
[0008]检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力；
[0009]所述双荧光素酶报告质粒包括recA基因的启动子。
[0010]进一步地，所述recA基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0011]进一步地，所述recA基因的启动子包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0012]进一步地，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：
[0013]将所述recA基因的启动子构建至pMCS
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Fluc
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SV40
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hRluc
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Neo质粒第5095bp的位置
[0014]进一步地，所述微生物为大肠杆菌。
[0015]进一步地，所述将双荧光素酶报告质粒转入微生物中包括：
[0016]通过离子转化法、电穿孔法、冷冻脉冲法、热激法或静电吸附法将所述双荧光素酶报告质粒包含的质粒转入所述微生物的感受态细胞中。
[0017]进一步地，所述荧光信号包括：萤火虫荧光素酶的荧光信号和海肾萤光素酶的荧光信号。
[0018]进一步地，所述根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力包括：
[0019]将所述萤火虫荧光素酶的荧光信号和所述海肾萤光素酶的荧光信号的比值和对照比值进行比对；根据比对结果判断所述待测样品对于Stx2噬菌体激活的抑制能力；
[0020]所述对照比值为根据不包括所述recA基因的启动子的同种双荧光素酶报告质粒转入同种微生物中，检测荧光信号，并根据结果确定得到。
[0021]第二方面，本专利技术提供RrecA基因的启动子的核酸作为抑制Stx2噬菌体激活能力的标志物的应用。
[0022]本专利技术进一步提供所述的方法在检测化合物抑制Stx2噬菌体激活的能力中的应用。
[0023]本专利技术进一步提供L
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阿拉伯糖在抑制Stx2噬菌体激活中的应用。
[0024]进一步地，所述微生物为大肠杆菌。
[0025]本专利技术具备如下有益效果：
[0026]本专利技术将recA基因的启动子构建至双荧光素酶表达质粒中，并进一步转入微生物中得到一种可以验证化合物对于微生物生产Stx2能力的抑制功能的双荧光素酶报告系统。该双荧光素酶报告系统的荧光活性与Stx2噬菌体产量有着一致的变化趋势，因此可以经由荧光信号的变化指示Stx2噬菌体产量，进而就能够判断出化合物抑制Stx2噬菌体激活的能力。本专利技术提供的双荧光素酶报告系统可以应用筛选可特异性抑制Stx2噬菌体激活的功能性营养素，并且具备较优的准确率。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1是本专利技术实施例1提供的pRECA(E.coli)
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Fluc
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SV40
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hRluc
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Neo质粒谱图。
[0029]图2是本专利技术实施例1提供的pMCS
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Fluc
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SV40
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hRluc
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Neo空载质粒图谱。
[0030]图3是本专利技术实施例1提供的经过包含不同功能性糖的培养基培养的菌株的Stx2噬菌体的产量示意图。
[0031]图4是本专利技术实施例1提供的经过包含不同功能性糖的培养基培养的菌株的相对荧光值结果示意图。
具体实施方式
[0032]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术中的附图，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例1
[0034]本实施例提供一种双荧光素酶报告系统
[0035]1、菌株来源和生长条件
[0036]大肠杆菌O157:H7来源于中国农业大学谯仕谚教授实验室。细菌在营养肉汤(LB)(北京奥博兴生物技术有限公司，中国北京)培养基中生长，生长环境温度为37℃
[0037]2、大肠杆菌recA双荧光素酶报告质粒的构建
[0038]将本专利技术设计的recA基因启动子序列在pMCS
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Fluc
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SV40
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hRluc
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Neo质粒中构建大肠杆菌recA基因双荧光素酶报告载体。该步骤可以通过本领域常规方法实现，例如人工合成recA基因启动子的片段，之后通过酶切连接等方式整合至pMCS
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Fluc
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Neo质粒中(构建后的质粒图谱如图1所示，其中recA基因启动子序列为图中的promoter(e.coli)，位置为5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选抑制Stx2噬菌体激活的化合物的方法，其特征在于，包括：将双荧光素酶报告质粒转入微生物中，在培养的过程中加入待测样品；检测荧光信号，并根据结果判断所述待测样品抑制Stx2噬菌体激活的能力；所述双荧光素酶报告质粒包括recA基因的启动子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述recA基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述recA基因的启动子包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双荧光素酶报告质粒通过如下方法制备得到：将所述recA基因的启动子构建至pMCS
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Fluc
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SV40
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hRluc
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Neo质粒第5095bp的位置。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军军，胡杰，武祎凡，韩丹丹，康露渊，刘一思，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：