一种A型肉毒毒素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的制备方法，在P0DP10蛋白数据库设计BoNT/A氨基酸序列，通过同源重组法将His标签和SUMO标签序列插入BoNT/A氨基酸序列N端，再通过SUMO标签蛋白酶在GG

【技术实现步骤摘要】
ID NO 2和ESQ ID NO 3；
[0008](a)编码BoNT/A的Lc区域，序列如SEQ ID NO1所示，氨基酸序列如PRO NO1所示；
[0009](b)编码凝血酶酶切位点，序列如SEQ ID NO2所示，氨基酸序列如PRO NO2所示；
[0010](c)编码BoNT/A的Hc区域，序列如SEQ ID NO3所示，氨基酸序列如PRO NO3所示。
[0011]优选地，通过同源重组法将组合标签插入BoNT/A的氨基酸序列N端，即设计得到的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示的。
[0012]优选地，所述组合标签为His标签和SUMO标签。
[0013]本专利技术的目的之二，重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014](1)设计和构建重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示的；
[0015](2)BoNT/A表达载体的设计和连接制备；
[0016](3)BoNT/A蛋白的诱导表达和菌体收集；
[0017](4)菌体上清的亲和纯化；
[0018](5)酶切去除SUMO标签并激活BoNT/A蛋白。
[0019]优选地，所述酶切去除SUMO标签并激活BoNT/A蛋白的实验步骤为：SUMO标签酶酶切后，再按照1mg蛋白加入1u凝血酶。
[0020]优选地，所述BoNT/A蛋白的诱导表达步骤为：菌体OD
600
为0.6后加入终浓度为1mM IPTG 30℃诱导培养12h。
[0021]优选地，所述菌体收集步骤为：4000rpm离心收集菌泥，利用40ml 20mM PB+150mM Nacl，pH 7.2重悬，420W冰浴超声破碎，超声3S，间隔5S，持续15min；12000rpm，4℃离心20min离心再次收集上清；
[0022]所述菌体上清的亲和纯化的具体步骤为：离心收集的上清经过0.22um滤膜过滤后进行Ni柱亲和富集纯化，其中平衡缓冲液为20mM PB+150mM NaCl,清洗缓冲液为20mM PB+150mM NaCl+5mM咪唑、20mM PB+150mM NaCl+20mM、20mM PB+150mM NaCl+50mM咪唑、20mM PB+150mM NaCl+80mM咪唑，洗脱缓冲液为20mM PB+150mM NaCl+300mM咪唑,试剂酸碱度均为pH8.0。
[0023]本专利技术的目的之三，通过上述方法制备得到的重组BoNT/A多肽。
[0024]本专利技术的目的之四，通过上述方法制备得到的重组BoNT/A多肽在制备药物中的应用。
[0025]有益效果：
[0026]本专利技术提供了一种重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的制备方法，在P0DP10蛋白数据库设计BoNT/A氨基酸序列，通过同源重组法将His标签和SUMO标签序列插入BoNT/A氨基酸序列N段的设计，再通过SUMO蛋白酶在GG
‑
M之间进行切割，不会有任何标签和SUMO序列的氨基酸残留。
[0027]当凝血酶用量为0u时，目的蛋白并未呈现两个片段，使得BoNT/A蛋白未被激活，即得到无活性的BoNT/A蛋白；当凝血酶用量分别为0.5u、1u、2u和3u时，只有按照1mg蛋白加入1u、2u和3u时凝血酶时，凝血酶切后目的蛋白呈现两个片段，且上清液纯化得到的BoNT/A蛋白更多的被激活，同时又考虑到使用凝血酶的量越大，越不安全风险问题，所以本方案优选按照1mg蛋白加入1u凝血酶。
[0028]还有通过对比实验，结果显示以SUMO标签标记时，选择菌体离心上清液进行标签去除的酶切和A型肉毒毒素蛋白多肽的激活，对标签的去除和多肽的激活均体现更为高效；动物实验限制，上述上清制备纯化并激活得到的重组A型肉毒毒素多肽毒力更强，因此在实际应用中，副作用和刺激也显著降低，具有更高的安全性。
附图说明：
[0029]图1：SUMO
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BoNT/A表达载体示意图
[0030]图2：pKMD
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SUMO空白质粒抽提鉴定结果
[0031]图3：BoNT/A分段PCR产物鉴定结果
[0032]图4：BoNT/A转化子PCR产物鉴定结果
[0033]图5：SUMO
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BoNT/A表达载体酶切鉴定
[0034]图6：表达菌株转化与鉴定
[0035]图7：BoNT/A目的蛋白上清纯化结果
[0036]图8：BoNT/A目的蛋白包涵体纯化结果
[0037]图9：目的蛋白SUMO标签酶切结果
[0038]图10：上清目的蛋白凝血酶酶切激活结果
[0039]图11：目的蛋白凝血酶激活结果
具体实施方式
[0040]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0041]实施例1：设计和构建BoNT/A的氨基酸序列
[0042](1)设计和构建BoNT/A的氨基酸序列，其氨基酸序列如ESQ ID NO 4所示；
[0043]重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列包括ESQ ID NO 1、ESQ ID NO 2和ESQ ID NO 3。
[0044](a)编码BoNT/A的Lc区域，序列如SEQ ID NO1所示，氨基酸序列如PRO NO1所示；
[0045](b)编码凝血酶酶切位点，序列如SEQ ID NO2所示，氨基酸序列如PRO NO2所示；
[0046](c)编码BoNT/A的Hc区域，序列如SEQ ID NO3所示，氨基酸序列如PRO NO3所示；
[0047]BoNT/A蛋白信息来源于Uniprot网站，其唯一蛋白数据库编号为P0DP10，网址链接为https://www.uniprot.org/uniprotkb/P0DPI0/entry。
[0048](2)通过同源重组法将组合标签插入BoNT/A的氨基酸序列N端，即设计得到的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示的。
[0049]其中组合标签为His标签和SUMO标签。
[0050]实施例2：BoNT/A表达载体的设计和连接制备
[0051](1)表达载体的选择：空白质粒作为BoNT/A表达载体骨架载体，通过获得的氨基酸进行密码子优化后获得再原核宿主中能够有益表达的基因密码子序列，再利用质粒构建设计软件Snapgene进行理论上的序列拼接，即载体示意图构建设计，获得完整的表达载体构
建示意图如图1所示。
[0052](2)表达载体的制备：首先对空白质粒进行抽提和鉴定，鉴定结果如图2所示，左侧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组A型肉毒毒素(BoNT/A)，其特征在于：其氨基酸序列如ESQ ID NO 4所示。2.如权利要求1所述的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)，其特征在于，所述重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列包括ESQ ID NO 1、ESQ ID NO 2和ESQ ID NO 3；(a)编码BoNT/A的Lc区域，序列如SEQ ID NO1所示，氨基酸序列如PRO NO1所示；(b)编码凝血酶酶切位点，序列如SEQ ID NO2所示，氨基酸序列如PRO NO2所示；(c)编码BoNT/A的Hc区域，序列如SEQ ID NO3所示，氨基酸序列如PRO NO3所示。3.如权利要求2所述的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)，其特征在于，通过同源重组法将组合标签插入BoNT/A的氨基酸序列N端，即设计得到的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示的。4.根据权利要求3所述的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)，其特征在于，所述组合标签为His标签和SUMO标签。5.根据权利要求4所述的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计和构建重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示的；(2)BoNT/A表达载体的设计和连接制备；(3)BoNT/A蛋白的诱导表达和菌体收集；(4)菌体上清的亲和纯化；(5)酶切去除SUMO标签并激活BoNT/A蛋白。6.根据权利要求5所述的重组A型肉毒毒素(BoNT/A)的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：江志华，侯曦凡，王斌，
申请(专利权)人：深圳德进生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：