一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法制造技术

本发明专利技术涉及一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法，属于生物分析检测技术领域。本发明专利技术基于TMSD系统构建了一种靶循环体系：MecA驱动TMSD的发生，置换出具有DNA酶结构的单链DNA(Dz)，在Fuel链的参与下，MecA基因被置换下来去驱动新一轮TMSD，循环扩增出Dz。Dz链能够在钾离子等条件下形成G

【技术实现步骤摘要】
一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法


[0001]本专利技术涉及生物分析检测
，尤其是指一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌是一种常见的人畜共患致病菌，是化脓性感染最常见的病原菌，人体感染后能够引起皮肤感染、尿路感染、心内膜炎甚至休克等一系列临床疾病，具有较高的治病率和致死率。而早期治疗金黄色葡萄球菌的首选药物为甲氧西林，由于甲氧西林抗生素的误用、滥用以及持续使用，导致金黄色葡萄球菌突变成了“超级细菌”：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是院内感染的主要病原菌之一，因其感染率高、对多数β
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内酰胺类抗生素具有耐药性、治疗困难，使得临床上的治疗效果和治疗成本大大增加，因此，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在临床上具有极其重要的意义。
[0003]目前，对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因检测的主要临床方法有荧光免疫分析、电化学检测以及以聚合酶链反应分析(PCR)为基础的一系列检测方法，比如：传统PCR、荧光定量PCR、双重PCR等。虽然这些检测方法具有重复性好、特异性高等优点，但无一例外，这些方法都存在着一些缺点限制了临床上的广泛应用，比如：检测成本高、检测周期长、检测程序复杂、需要专业的仪器及操作人员等。故迫切需要一种具有优异检测灵敏度、简单检测条件、低成本的检测方法对MecA基因进行检测。
[0004]富含鸟嘌呤碱基(G)的DNA序列在钾离子存在的情况下，通过氢键作用折叠成特殊的G
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四链体结构，当与Hemin结合后形成具有类过氧化物酶活性的DNA酶，能催化H2O2从而将无色的还原型ABTS短时间内氧化生成绿色的ABTS阳离子自由基，此自由基在420nm处具有最大紫外吸收。相比于天然酶，DNA酶具有稳定性高、成本低、检测条件简单等优势；相比于其他的核酸扩增技术，如滚环扩增、重组酶介导扩增、环介导等温扩增等，立足点链置换扩增技术不需要其它酶的参与便能实现有效的核酸扩增，同时，通过立足点启动链置换的置换速率是普通链置换速率的106倍；GO是含有羧基、羟基、酚羟基等基团的片状结构，因其在水中具有优异的分散性、比表面积大、官能团众多而广受研究者们关注，GO通过疏水相互作用以及π
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π共轭对单链DNA具有强烈的亲和力，而对双链DNA或者具有一定空间结构DNA的亲和力要低得多。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法，具体为一种基于Toehold介导的链置换反应(TMSD)的无酶信号扩增的石墨烯增强比色法用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因MecA高灵敏度检测的方法。可用于高效、灵敏检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术第一个目的是提供一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法，包括以下步骤：
[0008](1)构建Dz/Lock双链，加入Fuel单链，构成TMSD循环系统；
[0009](2)将含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的待测样品与促进G
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四联体形成的缓冲液加入步骤(1)所得TMSD循环系统中，孵育，得到显色混合物；
[0010](3)在步骤(2)所得显色混合物中加入氯化血红素混合反应，再加入显色底物ABTS与过氧化氢进行孵育，检测反应后所得溶液的吸光度，通过吸光度值实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的定性或定量分析。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)或为：在步骤(2)所得显色混合物中加入氧化石墨烯振荡反应，固液分离取固相，将所得固相溶于促进G
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四联体形成的缓冲液中后，滴加到滤膜上形成氧化石墨烯斑点，依次在氧化石墨烯斑点上滴加氯化血红素、ABTS和过氧化氢进行孵育，检测孵育后氧化石墨烯斑点的灰度值，通过灰度值实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的定性或定量检测。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述Dz/Lock双链的构建方法为：
[0013]将单链Dz与单链Lock等体积混合，退火，形成Dz/Lock双链。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，所述单链Dz的序列为ATGAACTGATTATACAAGGGTAGGGCGGGTTGGGA。
[0015]所述单链Lock的序列为TACCCTTGTATAATCAGTTCATCACTCCA。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述Fuel单链的序列为TGGAGTGATGAACTGATTATAC。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述TMSD循环系统中溶液反应总体积为500μL，其中Dz/Lock双链和Fuel单链的终浓度均为200nM。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MecA基因(耐药基因)与所述Dz/Lock双链中的Lock链的部分基因互补配对；所述MecA基因的序列为TGGAGTGATGAACTGATTATAC。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的待测样品中MecA基因的浓度为333fM～1.5nM。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述促进G
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四联体形成的缓冲液还包括Tris、KCl与NaCl；所述促进G
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四联体形成的缓冲液的pH值为7.0
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7.4。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述孵育的条件为：25℃孵育8min
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10min。
[0022]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，结合Hemin的G
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四联体能够表现出类过氧化物酶活性，其能催化H2O2从而将无色的还原型ABTS短时间内氧化生成绿色的ABTS自由基，此自由基在420nm处具有最大紫外吸收。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，自由的Dz链有一个长单链的尾部，其与GO具有很强的非共价结合能力，自由的Dz链可以自组装到GO表面并形成Dz/GO复合物，通过15000r/min离心30分钟可以将Dz/GO复合物与溶液进行分离，同时，Dz/GO复合物可重新分散在小体积溶液中从而达到浓缩的效果。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，GO具有一定的片直径和厚度，因此，Dz/GO复合物很容易被堵塞并积聚在滤膜上，有效的防止了Dz/GO复合物的分散，从而达到聚集的效果，所使
用的滤膜为国药集团0.8μm孔径的微孔滤膜。
[0025]在本专利技术的一个实施例中，灰度值的测量是通过使用智能手机拍摄比色照片，通过Image J软件进行分析计算得来，灰度值变化率＝【灰度值(实验组)
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灰度值(对照本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于立足点链置换和氧化石墨烯检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比色法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建Dz/Lock双链，加入Fuel单链，构成TMSD循环系统；（2）将含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的待测样品与促进G
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四联体形成的缓冲液加入步骤（1）所得TMSD循环系统中，孵育，得到显色混合物；（3）在步骤（2）所得显色混合物中加入氯化血红素混合反应，再加入显色底物ABTS与过氧化氢进行孵育，检测反应后所得溶液的吸光度，实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的定性或定量分析。2.根据权利要求1所述的比色法，其特征在于，步骤（3）或为：在步骤（2）所得显色混合物中加入氧化石墨烯振荡反应，固液分离取固相，将所得固相溶于促进G
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四联体形成的缓冲液中后，滴加到滤膜上形成氧化石墨烯斑点，依次在氧化石墨烯斑点上滴加氯化血红素、ABTS和过氧化氢进行孵育，检测孵育后氧化石墨烯斑点的灰度值，实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的定性或定量检测。3.根据权利要求1所述的比色法，其特征在于，步骤（1）中，所述Dz/Lock双链的构建方法为：将单链Dz与单链Lock等体积混合，退火，形成Dz/Lock双链。4.根据权利要求3所述的比色法，其特征在于，所述单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雨婷，周楠迪，郭宗康，王晓丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：