一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组、试剂盒及快速区分方法技术

本发明专利技术公开了一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组、试剂盒及快速区分方法，属于试剂盒检测技术领域。该引物组是基于RNF7基因在脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞中表达存在显著差异，提出RNF7可以作为干细胞的特殊标志物用于脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的区分和鉴定。该快速区分方法快捷简便，能在很短时间内鉴定脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞，价格低廉，具有较高参考价值，适于推广应用。该试剂盒灵敏度高，只需要15pg模板cDNA即可检测。试剂盒中引物组均为经过大量试验验证成功的高特异性引物，与目的基因2个特定片段结合，具有高特异性和灵敏度。具有高特异性和灵敏度。具有高特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组、试剂盒及快速区分方法


[0001]本专利技术属于试剂盒检测
，具体涉及一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组、试剂盒及快速区分方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞是良好的生物材料，目前被用于糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中，肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化、肝硬化、肺纤维化和移植物抗宿主病等。间充质干细胞具有良好的生物学性能，具有高速增殖、多谱系分化、免疫调节、无材料易得且无伦理问题等优点，是再生医学的优良材料，被广泛应用于组织再生工程中。人脱落乳牙牙髓干细胞（hSHED）是从儿童自然脱落牙齿的牙髓组织中分离得到的间充质干细胞，具有多种优秀的性能，相比于骨髓间充质干细胞具有更快的增殖速率，其特点是可以在诱导条件下分化为牙本质细胞细，被重点应用于牙科组织再生工程中，且近些年已经有相关的临床试验开展并取得积极效果。人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）是应用最广泛的间充质干细胞，材料易得且具有优秀的生物学性能，迄今为止已经在国内外开展了众多疾病的临床前和临床研究，如特发性肺纤维化、膝关节骨关节炎、2型糖尿病、缺血性中风、脊髓损伤、肝硬化、系统性红斑狼疮和溃疡性结肠炎等，是干细胞疗法的热点。
[0003]脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞是具有高速增殖的特点，在诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞和肝细胞样细胞等，且阳性表达标志物CD105、CD73和CD90。作为一种间充质干细胞，脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞都表现了明显的间充质特征，在显微镜下呈现成纤维状，细胞形态不存在差异，流式细胞术检测都是阳性表达间充质标志物且不表达造血干细胞标志物，所以在形态学和表面特征上难以区分两种细胞。但是，脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞在功能和研究应用中存在巨大差异，脱落乳牙牙髓干细胞更倾向于应用于牙科组织工程，而脐带间充质干细胞更倾向于抗炎性疾病，所以区分两种干细胞是非常必要的，是干细胞疗法的基础。但是，目前在市场上还没有一种可以有效区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的方法和产品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的在于提供一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组，该引物组是基于RNF7基因在脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞中表达存在显著差异，提出RNF7可以作为干细胞的特殊标志物用于脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的区分和鉴定。
[0005]本专利技术的第二目的在于提供一种快速区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的方法，该方法利用试剂盒或是引物组，区分时快捷简便，能在很短时间内鉴定脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞，价格低廉，对于脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干
细胞的区分和牙科组织工程具有较高参考价值，适于推广应用。
[0006]本专利技术的第三目的在于提供一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的试剂盒，该试剂盒灵敏度高，只需要15 pg 模板cDNA即可检测。该试剂盒中引物组是根据细胞中特异表达分子RNF7设计的3对引物，均为经过大量试验验证成功的高特异性引物，与目的基因2个特定片段结合，具有高特异性和灵敏度。
[0007]本专利技术通过以下技术方案实现：一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组，包括RNF7基因的三对引物组，具体为：SEQ ID No.1：
‑ꢀ
CCAGGTGATGGATGCCTGTCTTA
‑
；SEQ ID No.2：
‑ꢀ
TCTCCCCAGACCACAACACA
‑
；SEQ ID No.3：
‑ꢀ
TGGGACGTGGAGTGCGATA
‑
；SEQ ID No.4：
‑ꢀ
CTTGACATCTAAGACAGGCATCCA
‑
；SEQ ID No.5：
‑ꢀ
AAGTCGGGAGGCGACAAGA
‑
；SEQ ID No.6：
‑ꢀ
TGACATCTAAGACAGGCATCCATC
‑
。
[0008]一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的试剂盒，包括所述的特异性引物组。
[0009]作为优选地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、内参基因引物、反转录试剂和qPCR试剂。
[0010]作为优选地，所述内参基因为GAPDH；所述内参基因引物具体为：SEQ ID No.7：
‑ꢀ
CCATGGGGAAGGTGAAGGTC
‑
；SEQ ID No.8：
‑ꢀ
AGTGATGGCATGGACTGTGG
‑
。
[0011]一种快速区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的方法，使用所述的引物组或所述的试剂盒进行快速区分。
[0012]作为优选地，包括如下步骤：S1、将待区分的细胞样品进行培养后采用Trizol法提取总RNA，定量后反转录成cDNA，S2、利用所述的引物组或所述试剂盒中的引物进行荧光定量PCR扩增反应；S3、通过2
（
‑
ΔΔCt）
计算RNF7基因的相对表达量。
[0013]作为优选地，所述S1中，模板cDNA的量为15 pg。
[0014]作为优选地，所述S2中，引物浓度为2 pmol/
µ
L。
[0015]与现有技术相比，本专利技术至少具有如下技术效果：（一）本专利技术提供一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组，该引物组是基于RNF7基因在脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞中表达存在显著差异，提出RNF7可以作为干细胞的特殊标志物用于脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的区分和鉴定。该方法是通过利用差异和计算p值进行。
[0016]（二）该快速区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的方法，该方法利用试剂盒或是引物组，区分时快捷简便，能在很短时间内鉴定脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞，价格低廉，对于脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的区分和牙科组织工
程具有较高参考价值，适于推广应用。
[0017]（三）该区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的试剂盒，该试剂盒灵敏度高，只需要15 pg 模板cDNA即可检测。该试剂盒中引物组是根据细胞中特异表达分子RNF7设计的3对引物，均为经过大量试验验证成功的高特异性引物，与目的基因2个特定片段结合，具有高特异性和灵敏度。
[0018]（四）本专利技术是从高分辨质谱中解析的蛋白表达谱图后，进行生物信息学分析和验证后得到的，由此开发的试剂盒。由于本专利技术前期使用的细胞经过严格质控，并通过适应症的疗效评估，故而其中一个重要应用是解决当脐带间充质为对照品时，筛选表达量不达标的hSHED。另外，该分子也具有重要生物学功能功能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的特异性引物组，其特征在于，包括RNF7基因的三对引物组，具体为：SEQ ID No.1：
‑ꢀ
CCAGGTGATGGATGCCTGTCTTA
‑
；SEQ ID No.2：
‑ꢀ
TCTCCCCAGACCACAACACA
‑
；SEQ ID No.3：
‑ꢀ
TGGGACGTGGAGTGCGATA
‑
；SEQ ID No.4：
‑ꢀ
CTTGACATCTAAGACAGGCATCCA
‑
；SEQ ID No.5：
‑ꢀ
AAGTCGGGAGGCGACAAGA
‑
；SEQ ID No.6：
‑ꢀ
TGACATCTAAGACAGGCATCCATC
‑
。2.一种区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的特异性引物组。3.根据权利要求2所述的区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、内参基因引物、反转录试剂和qPCR试剂。4.根据权利要求3所述的区分脐带间充质干细胞和脱落乳牙牙髓干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪阳，雷建慧，赵雅宁，刘彦彦，
申请(专利权)人：北京葆来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：