蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。本发明专利技术发现肝细胞癌患者肝癌组织中髓过氧化物酶(MPO)和丙酮酸激酶(PKM)的表达量可以用于肝细胞癌患者的预后或精准预后分层，在MPO高表达患者中，仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好。本发明专利技术可利用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层。用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域中，蛋白质组合在制备对肝细胞癌患者精准预后分层试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]中性粒细胞在肿瘤进展中作用的两面性越来越被研究者们所关注，因此提出了中性粒细胞的两种极化状态以区分肿瘤相关中性粒细胞(TANs)的不同功能——抗肿瘤中性粒细胞(N1)和促肿瘤中性粒细胞(N2)1(类似不同极化状态的巨噬细胞)。近年来一系列研究表明TANs通过直接促进肿瘤细胞增殖及侵袭、加强胞外基质重构及血管生成、维持免疫抑制性微环境等方式促进肿瘤进展2‑4。然而，目前关于是否存在真正意义的N1、N2中性粒细胞亚群，及其在肿瘤发展和预后中的意义仍存有争议，并且，中性粒细胞的动态异质性受其定植的组织微环境影响很大，这进一步限制了其作为标志物应用于肿瘤诊疗。
[0003]近年来研究发现，恶性HCC患者外周血中心粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)增高5，并且患者肝癌组织中会出现大量弥散性中性粒细胞浸润6，因此，2019年最新版WHO肿瘤分类(消化系统)指南定义了一种新的HCC病理亚型——中性粒细胞浸润型，并将中性粒细胞作为患者不良预后的标志物。然而，按照指南标准(中性粒细胞浸润比例>50％)，该型HCC患者在总患者人群中占比<1％，这大大限制了在临床实践中将中性粒细胞作为标志物应用于HCC诊疗，并且其中并没有考虑到中性粒细胞异质性对患者预后的不同意义7。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何对中性粒细胞高浸润HCC患者预后实施精准分层。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶(MPO,Uniprot编号：P05164)和/或丙酮酸激酶(PKM，Uniprot编号：P14618)。
[0006]其中，精准预后分层是指利用MPO与PKM表达丰度对肝细胞癌患者的生存期或不同时间(如12个月、24个月、60个月等)内的生存率进行预后分析。
[0007]上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质可包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。
[0008]所述质谱可为数据依赖型串联质谱。
[0009]上述应用中，免疫组织化学染色检测所用物质可为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。
[0010]上述应用中，所述髓过氧化物酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
[0011]上述应用中，所述丙酮酸激酶的表达量可为其在肝癌组织中的表达量。
[0012]上述应用中，所述检测蛋白质组合表达量的物质还可包括数据分析模型，所述数
据分析模型用于将所述蛋白质组合表达量数据输入COX回归模型，根据模型结果将患者分为高风险组或低风险组。
[0013]本专利技术中，肝细胞癌预后分层方法可通过将无标定量质谱(或免疫组化)检测的MPO表达量和PKM表达量输入Cox回归模型获得。
[0014]本专利技术中，无标定量质谱蛋白表达量可通过如下方法获得：
[0015]1.数据产生方法
[0016]首先获取肝细胞癌患者的样本队列以及预后随访数据，同时获取手术切除的肝细胞癌组织样本，将样本进行蛋白提取、酶解后，通过iBAQ无标定量方法进行高通量样本制备，随后通过数据依赖性质谱采集技术获取质谱数据，谱图原始文件使用MaxQuant软件进行定量解析，得到样本蛋白质组定量信息结果。
[0017]2.数据预处理方法
[0018]对于得到的蛋白质表达矩阵，使用R语言软件程序包limma中的quantile算法进行标准化，对于缺失值使用全局最小值进行插补。
[0019]本专利技术发现，在MPO高表达患者中，仅PKM同时高表达的HCC患者预后较差,而当PKM低表达时，患者的预后仍然较好。可利用MPO和PKM对肝细胞癌患者精准预后分层利用联合标志物MPO和PKM精准分层中性粒细胞高浸润HCC患者的预后，从而补充现行基于中性粒细胞诊断HCC患者预后的临床指南。
[0020]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术
[0021]人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
附图说明
[0022]图1为流程分析图。
[0023]图2为独立HCC人群中MPO低表达HCC、MPO高表达HCC、以及MPO高表达HCC中PKM高表达、低表达HCC患者的Kaplan
‑
Meier生存分析。
[0024]图3为IHC检测MPO低表达HCC、MPO高表达HCC、以及MPO高表达HCC中PKM达高表、低表达HCC患者的Kaplan
‑
Meier生存分析。
具体实施方式
[0025]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0026]实施例1、利用MPO+PKM组合标志物精准筛选预后不良的中性粒细胞高浸润HCC患者分析流程如图1所示。
[0027]1、样本纳入
[0028]经患者知情同意，从复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院收集接受了外科手术切除的早期肝细胞癌患者。排除标准如下：(1)术前接受了化疗或放疗；(2)非初次手术；(3)非巴塞罗那分期0期或A期；(4)存在HCV感染；(5)失访或临床资料不全。最终共纳入101例肝
细胞癌患者，纳入标准如下：(1)巴塞罗那分期0期或A期肝细胞癌患者；(2)切除组织足够可以进行蛋白质组学数据产出；(3)随访信息与临床资料齐全。本研究得到了复旦大学中山医院和北京大学肿瘤医院伦理委员会的批准。
[0029]术后对患者进行随访，如死亡，预后时间记录为术后到死亡的时间间隔，若未死亡，预后时间记录为术后到最后一次随访的时间间隔，作为右删失数据。
[0030]2、蛋白质组学数据获取及预处理
[0031]肝癌组织蛋白提取。取肝细胞癌患者的的冷冻肿瘤组织，加入含蛋白酶抑制剂(Roche，货号为04693116001)和磷酸酶抑制剂(Roche，货号为04906837001)的T
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PER组织蛋白提取试剂(Thermo，货号为78510)裂解蛋白，经超声破碎仪(Scientz)破碎组织(25％振幅超声1min,其中超声3秒，间断3秒)，之后将所得液体在4度以16000g离心10分钟，取上清液作为组织蛋白提取物，使用Bradford蛋白定量试剂(Thermo，货号为23246)测定蛋白浓度。
[0032]超滤管辅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测蛋白质组合表达量的物质在制备肝细胞癌患者预后或精准预后分层试剂盒中的应用，所述蛋白质组合为髓过氧化物酶和/或丙酮酸激酶。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测蛋白质组合表达量的物质包括通过质谱和/或免疫组织化学染色检测髓过氧化物酶和丙酮酸激酶表达量的物质。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述质谱为数据依赖型串联质谱。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：免疫组织化学染色检测所用物质为髓过氧化物酶特异性抗体和/或丙酮酸激酶特异性抗体。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺福初，孙爱华，古智文，董乾，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：