一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用，属于基因工程技术领域。所述sgRNA包括sgRNA1或sgRNA2，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在γ珠蛋白近端启动子区域115bpBCL11A结合位点和自然的HPFH缺失的13nt处构建sgRNA，从而激活γ珠蛋白，提升胎儿血红蛋白的含量，以达到减轻中重型β地中海贫血症状的目的。本发明专利技术通过选择得到的sgRNA，安全性能高，为成功用于β地中海贫血的临床治疗提供实验依据。海贫血的临床治疗提供实验依据。海贫血的临床治疗提供实验依据。

【技术实现步骤摘要】
一种激活
γ
珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用。

技术介绍

[0002]血红蛋白英文缩写为HGB或Hb。血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是使血液呈红色的蛋白，由珠蛋白和血红素组成，其珠蛋白部分是由两对不同的珠蛋白链(α链和β链)组成的四聚体。地中海贫血(Thalassemia)是一组珠蛋白生成障碍性贫血，临床上主要分为α地中海贫血和β地中海贫血，其中β地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一。β地中海贫血治疗：轻型无须特殊治疗，中间型和重型根据临床症状的轻重进行治疗，目前主要治疗方式是长期高量输血联合规范性去铁治疗，但频繁输血容易引起心功能衰竭和铁过载，铁沉积可引起多脏器官功能损害，甚至发生多器官功能衰竭。异基因造血干细胞移植是目前唯一成熟的可治愈β地中海贫血的手段，但只有不到30％的地贫患儿可以获得合适的配型，且异基因造血干细胞移植后并发症，例如移植物抗宿主反应(GVHD)、感染等。基因治疗可作为根本上治疗β地中海贫血的有效方法，但基因治疗方式繁多，因此，需要寻求一种可行、高效、副作用小的基因治疗方式具有重大的社会意义，但现有基因治疗方法研究现状及优势有所不足，有待进一步优化。
[0003]人体血红蛋白的发育，在胎儿期主要为胎儿血红蛋白(HbF)，由2条α珠蛋白链和2条γ珠蛋白链组成的四聚体，出生后逐渐转变为成人血红蛋白。β地中海贫血是由于β珠蛋白基因突变引起的。β珠蛋白基因簇位于第11号染色体，由五个结构基因组成，分别是β、δ、Aγ、Gγ和ε基因，对应编码的血红蛋白分别是HBB、HBD、HBG1、HBG2和HBE。由于γ珠蛋白链有Gγ和Aγ两种亚型，故HbF构成：α2Gγ2和α2Aγ2。比较HbF中的γ珠蛋白和成人时期的β珠蛋白序列发现，这两种珠蛋白的序列同源性比较高，因此，γ珠蛋白和β珠蛋白功能上可以替换。
[0004]β地中海贫血的基因治疗策略主要集中在：(1)基因修正策略：通过基因编辑矫正β珠蛋白基因上发生突变的位置，但β珠蛋白基因突变种类繁多，在造血干细胞水平操作难度大；(2)基因增加策略：向细胞中引入正常的β珠蛋白替代异常珠蛋白，在国际上已开展了临床试验；(3)γ珠蛋白激活策略：主要通过控制γ珠蛋白的调控元件，例如抑制性顺式调控元件的缺失HBG1或HBG2启动子区或降低关键反作用因子的表达，可以在成体细胞中代替突变β珠蛋白的功能。γ珠蛋白激活策略通过激活内源性的γ珠蛋白替代异常β珠蛋白，具有非常大的潜力。
[0005]在β地中海贫血患者中重新激活γ珠蛋白，与游离α珠蛋白链结合形成可正常携氧的HbF，降低了α珠蛋白链和β珠蛋白链不平衡程度，可有效缓解患者症状。γ珠蛋白这种与发育相关的阶段性表达保证了机体血红蛋白的生理转换，调控这一生理转换过程的机制多样，包括LCR(Locus Control Region,区域控制区/DNase敏感位点)、转录因子、表观调控、
miRNA和lncRNA等。抑制性顺式调控元件的缺失HBG1或HBG2启动子区或降低关键反作用因子的表达为临床治疗β地中海贫血制定了切实可行的策略。
[0006]因各种遗传因素导致HbF在成人期持续表达增加，血液学检查正常的遗传综合征，被称为遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(Hereditary persistence fetal hemoglobin，HPFH)，携带者常无临床症状。HPFH根据基因缺陷的不同分为缺失型和非缺失型，缺失型HPFH是指由于β珠蛋白基因簇内大片段DNA序列缺失所致，该类型基因也是造成临床较常见的中间型地中海贫血的主要病理缺陷之一；非缺失型HPFH是由于γ珠蛋白基因启动子区域或其他修饰基因点突变或小片段的缺失，这些突变可能影响调节转录因子的结合。另外，其4他染色体上也有与HPFH相关的基因座。例如BCL11A(B
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cell lymphoma/leukemia,B淋巴细胞瘤因子)直接结合在γ珠蛋白基因启动子区域
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115位点的TGACCA序列上发挥功能，它既能影响LOOPS(β珠蛋白基因下游环状调控结构)结构与基因序列结合，也能与诸多转录因子如GATA1、TAL1等相互作用，以及与核作用因子和表观调控因子相互作用，多种途径抑制HBG的表达。HPFH患者血液学检查正常，无临床症状，不需要治疗，打破了正常珠蛋白基因开关机制的转换，根据HPFH珠蛋白基因顺序性表达调控的天然模型，通过基因编辑的方式构建类似于HPFH的模型是目前β地中海贫血基因治疗的又一个重要方法。
[0007]β地中海贫血的治疗，仅依靠传统的治疗方式已无法满足目前的治疗需求，基因治疗已成为研究热点，如何激活γ珠蛋白对β地中海贫血的基因治疗至关重要。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用，该CRISPR/Cas9复合体能够有效激活γ珠蛋白，提高胎儿血红蛋白含量，以达到治疗β地中海贫血的目的。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0010]本专利技术提供了一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA，包括sgRNA1或sgRNA2；
[0011]所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0012]所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013]本专利技术还提供了一种激活γ珠蛋白表达的CRISPR/Cas9复合体，所述CRISPR/Cas9复合体包括上述sgRNA。
[0014]优选的，所述CRISPR/Cas9复合体还包括Cas9蛋白。
[0015]优选的，所述Cas9蛋白通过pET
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NLS
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Cas9
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6xHis提取、纯化、浓缩得到。
[0016]优选的，所述提取的步骤包括将pET
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NLS
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Cas9
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6xHis转入宿主菌中培养得到含Cas9蛋白的菌体，裂解液重悬含Cas9蛋白的菌体，破碎，离心收集上清液。
[0017]优选的，所述纯化的步骤包括将上述上清液装入镍柱中，得到上样后的镍柱，冲洗镍柱，对冲洗后的镍柱进行洗脱，收集洗脱后的蛋白。
[0018]优选的，所述Cas9蛋白与sgRNA的质量比为2:1～10:1。
[0019]本专利技术还提供了一种上述sgRNA或CRISPR/Cas9复合体在制备提高胎儿血红蛋白含量的产品中的应用。
[0020]本专利技术还提供了一种上述sgRNA或CRISPR/Cas9复合体在制备治疗β地中海贫血药物中的应用。
[0021]本专利技术还提供了一种治疗β地中海贫血的药物，所述药物包括上述sgRNA或CRISPR/Cas9复合体。
[0022]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA，其特征在于，包括sgRNA1或sgRNA2；所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种激活γ珠蛋白表达的CRISPR/Cas9复合体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9复合体包括权利要求1所述sgRNA。3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9复合体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9复合体还包括Cas9蛋白。4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9复合体，其特征在于，所述Cas9蛋白通过pET
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NLS
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Cas9
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6xHis提取、纯化、浓缩得到。5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9复合体，其特征在于，所述提取的步骤包括将pET
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NLS
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【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，李燕，何志旭，范安然，周艳华，
申请(专利权)人：贵州医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：