【技术实现步骤摘要】
阳性血瓶细菌分离富集药敏检测方法、一体化芯片及制造方法
[0001]本申请属于微生物学检测
，尤其是涉及阳性血瓶细菌分离富集药敏检测方法、一体化芯片及制造方法。
技术介绍
[0002]血流感染（BSIs）是一种严重的全身感染性疾病，美国每年约有 250,000 例 BSI 病例发生。脓毒症是对包括 BSIs 在内的感染的全身反应，每年在全球范围内折磨约 1800 万人，并且每延迟一小时给予正确的抗生素治疗，死亡风险就会增加 9%。快速准确地鉴定病原体并且获知药物敏感性信息能极大程度的提高BSIs患者的生存率和改善患者预后。因此，寻求新的快速、准确的病原菌分离、以及耐药检测技术是实现临床耐药细菌感染快速和有效治疗的核心，也是突破目前抗生素滥用困境的关键。
[0003]目前临床上针对 BSIs 患者血液样本的抗生素耐药性检测过程需要三个过夜培养步骤：1、血培养；2、继代培养；3、病原菌的鉴定和抗生素敏感性试验 (AST) 培养。每个过夜培养过程都需要12
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24小时的时间，检测过程的总周转时间超过三天。
[0004]缩短BSIs 患者血液样本的抗生素耐药性检测的诊断时间与患者的死亡率之间有很强的相关性。缩短患者血液样本的抗生素耐药性检测过程的总周转时间是很有必要的。
技术实现思路
[0005]为了缩短检测时间，快速实现药敏检测，迅速采用靶向抗生素给药，降低患者死亡率，本申请提供阳性血瓶细菌分离富集药敏检测方法、检测芯片及制造方法，提供以下几个方面的技术方案。>[0006]第一方面，本申请提供阳性血瓶细菌分离富集药敏检测方法，采用以下技术方案实现。
[0007]一种阳性血瓶细菌分离富集药敏检测方法，包括以下步骤：(1)自进样口向分离腔内注入阳性血瓶样本；(2)在分离腔内分离菌体；(3)添加培养基；(4)将分离的菌液负压分样至与分离腔连通的药敏腔；(5)孵育。
[0008]通过上述技术方案，实现从阳性血瓶到药敏检测的快速完成。传统方法对患者血液样本的抗生素耐药性检测过程需要三个过夜培养步骤：1、血培养；2、继代培养；3、病原菌的鉴定和抗生素敏感性试验 (AST) 培养。每个过夜培养过程都需要12
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24小时的时间，检测过程的总周转时间超过三天。且要通过多种实验器具，多次转移培养环境，多次转换操作方式。本申请技术方案实现从阳性血瓶到药敏检测的一体化检测，在一个微流控芯片中就能完成。
[0009]本方案中采用的分离胶具有良好的触变性能和隔离性能。分离胶与血液在离心力的作用下，分离胶转化为低粘度流体，其比重在血细胞与血清之间，是血细胞和血清分离；静置后，分子间氢键重新形成网状结构，分离胶重新变成高粘度胶体，从而分离血细胞和血清。
[0010]优选的，步骤（2）所述的分离菌体的方法是物理方法，具体的是将样本与分离胶共同离心，使样本中的菌体位于分离胶上部。
[0011]通过上述技术方案，将阳性血瓶样本加入到微流控芯片的分离腔中，通过分离胶的离心，使其粘度变小而改变形状，将血细胞等影响纯菌获取或检测结果的物质隔离在分离胶下部，使分离胶上部只有部分菌体和上清液。分离胶上部主要聚集待检测的菌体，实现了待测菌体的快速分离。
[0012]优选的，所述步骤（4）的负压分样是通过进样口将药敏腔制成负压状态，恢复常压后，大气通过进样口将菌液压入药敏腔。
[0013]通过上述技术方案，实现快速的均匀分样，将带有菌体的培养液等量快速的转移到带有不同药物浓度的药敏腔中，进而完成菌体富集及药敏检测。
[0014]优选的，所述步骤（4）后，对分离腔进行快速离心操作，使菌液与药敏腔中的药物充分接触。
[0015]通过上述技术方案，药物集中放置于药敏腔的中部，菌液被分至药敏腔后，可能并没有与药物充分接触或者混合。通过快速离心操作，能够使菌液与药敏腔中的药物充分接触，提高检测结果的可靠性。
[0016]优选的，所述步骤（3）之后，对分离腔进行振荡重悬。
[0017]通过上述技术方案，通过振荡重悬能够充分将菌液与培养基混合充分，确保分配到每一个药敏腔中的等量体积的菌液中含有同等分量的菌体，提高检测结果的可靠性。
[0018]第二方面，本申请提供一种一体化芯片，通过以下技术方案实现。
[0019]一体化芯片，包括分离腔和与分离腔连通的药敏腔；所述分离腔设有进样口，所述分离腔内设有分离胶；所述药敏腔能够被制成负压状态，所述分离腔内的菌液能够被大气压入所述药敏腔。
[0020]通过上述技术方案，实现从阳性血瓶到细菌分离富集实现药敏检测的一体化，通过一次取血到微流控芯片中，即可完成全部分离富集及检测过程，无需更换培养环境，继代培养，过夜培养等复杂又耗时的检测过程。
[0021]优选的，所述药敏腔设有尖角端。
[0022]通过上述技术方案，细菌富集量通过尖角端能够较为直观的对比，因为检测药敏是要各种浓度的药物结果进行对比，而样本量少，菌体的富集程度区别不明显，如果在较大空间内对比，不易察觉各浓度药物的药敏腔中的菌体的富集程度的差别。所以采用带有尖角端的药敏腔，通过离心富集，便于观察尖角端的富集情况，得到较为准确的药敏检测结果。
[0023]第三方面，本申请提供一种一体化芯片的制备方法，通过以下方案实现。一体化芯片的制造方法，包括以下步骤：(1)制作腔体及通道；
(2)在腔体内放置分离胶或者待测药物；(3)封闭腔体和通道，预留进样口。
[0024]通过上述技术方案，本申请能够实现在微流控芯片内放置分离胶，通过分离胶与阳性血瓶样本的离心，可以将样本中的血细胞分离到分离胶的下部，直接获得带有细菌的上清液，从而为实现一体化检测提供基础。
[0025]优选的，所述步骤(1)为：在底板层设置分离腔和与分离腔连通的药敏腔；所述底板层的一侧刻有通道，所述通道的高度小于所述底板层的高度；所述步骤(2)为：在分离腔点涂分离胶，在药敏腔点涂待测药物或培养基；所述步骤(3)为：在底板层上部贴合顶板层制成微流控芯片，顶板层设有通孔，通孔与分离腔连通，位于分离腔远离分离胶的一端。
[0026]通过上述技术方案，采用较厚的材料，在材料上刻出深度较小的通道和药敏腔，刻出较深厚度的分离腔，以便在分离腔内放置分离胶及培养基，因为需要点涂分离胶和再次添加新鲜培养基以供药敏孵育，分离胶的体积较待测药物体积大很多，所以要有这种深度差。再将放置了分离胶和待测药物的分离腔和药敏腔封装起来，留出进样口，完成一体化芯片的制作。
[0027]优选的，(1)在双面胶上刻出腔体和通道，所述腔体和通道都穿透双面胶，形成双面胶层；在承胶层上刻出镂空的分离腔；将封装层贴合在所述承胶层的一侧，预留作为进样口的镂空处；(2)在封装层靠近承胶层的一侧点涂分离胶；在承胶层远离封装层的一侧贴合双面胶层，在承胶层远离封装层的一侧、双面胶层镂空处点涂待测药物或者培养基；(3)待药物干燥后，在双面胶层远离承胶层的一侧贴合顶板层。
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.阳性血瓶细菌(11)分离富集药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)自进样口(1)向分离腔(2)内注入阳性血瓶样本(9)；(2)在分离腔(2)内分离菌体；(3)添加培养基(13)；(4)将分离的菌液负压分样至与分离腔(2)连通的药敏腔(8)；(5)孵育。2.根据权利要求1所述的阳性血瓶细菌(11)分离富集药敏检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的分离菌体的方法将阳性血瓶样本(9)与分离胶(3)共同离心，使阳性血瓶样本(9)中的菌体位于分离胶(3)上部。3.根据权利要求1或2所述的阳性血瓶细菌(11)分离富集药敏检测方法，其特征在于：所述步骤（5）的负压分样是通过进样口(1)将药敏腔(8)制成负压状态，恢复常压后，大气通过进样口(1)将菌液压入药敏腔(8)。4.根据权利要求1或2所述的阳性血瓶细菌(11)分离富集药敏检测方法，其特征在于：所述步骤（5）后，对分离腔(2)进行离心操作，使菌液与药敏腔(8)中的药物充分接触。5.根据权利要求1或2所述的阳性血瓶细菌(11)分离富集药敏检测方法，其特征在于：所述步骤（3）之后，对分离腔(2)进行振荡重悬。6.一体化芯片，其特征在于：包括分离腔(2)和与分离腔(2)连通的药敏腔(8)；所述分离腔(2)设有进样口(1)，所述分离腔(2)内设有分离胶(3)；所述药敏腔(8)能够被制成负压状态，所述分离腔(2)内的菌液能够被大气压入所述药敏腔(8)。7.根据权利要求8所述的一体化芯片，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：马波，朱梅佳，徐腾，吴非，刁志钿，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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