Ghrelin通过Tim-3介导的HMGB1/NF-κB通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种Ghrelin通过Tim

【技术实现步骤摘要】
Ghrelin通过Tim
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3介导的HMGB1/NF
‑
κ
B通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法


[0001]本专利技术涉及动脉瘤性蛛网膜下腔出血研究
，尤其涉及一种Ghrelin通过Tim
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3介导的HMGB1/NF
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κB通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法。

技术介绍

[0002]动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)更常见于年轻患者，占中风的5％
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7％。尽管在过去的几十年里，神经重症、神经介入诊疗水平取得了良好的进步，降低了病死率，但SAH仍然是一种高致残率疾病，只有三分之二的幸存者恢复了功能独立性。近年来，早期脑损伤(EBI)概念逐渐被重视，主要在出血后3天内发生，是SAH患者不良预后的主要预测因子。SAH诱导EBI的潜在机制是多因素的，如氧化应激、神经元凋亡、血脑屏障破坏、脑水肿和神经炎症等。神经炎症、细胞凋亡在脑损伤中作用极其重要，如能找到控制细胞凋亡的“开关”因子，则其下游的多种损伤信号因子将被最大限度控制。
[0003]Ghrelin是一种脑肠激素，主要在人胃底部的P/D1细胞和胰腺的ε细胞产生的一种肽，含有28个氨基酸的肽，其分泌用于调节生长激素释放和促进肥胖。Ghrelin已被确定为生长激素促泌素受体
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1(GHSR
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1)的唯一内源性配体。GHSR
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1是一种广泛存在于中枢神经系统的G蛋白偶联受体。已有研究表明，Ghrelin可减少促炎细胞因子如TNF
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α、IL
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6和IL
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1β的释放。T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白(Tim
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3)参与促炎细胞因子的产生。此外，Tim
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3可增强大鼠SAH后高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达，加重SAH后的神经炎症。HMGB1是一种广泛表达于中枢神经系统的核蛋白。细胞外HMGB1是SAH后与EBI相关的促炎细胞因子。HMGB1从神经元和星形胶质细胞释放后，开始产生多种炎症标志物，包括TNF
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α、IL
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6和IL
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1β。
[0004]目前研究发现早期脑损伤(early brain injury,EBI)及迟发性脑血管痉挛是致残、致死的重要原因。在过去数十年中，大多数研究主要集中在SAH后迟发性脑血管痉挛，并认为其为SAH后致死性并发症。直到缓解脑血管痉挛的临床药物Clazosentan临床实验失败，研究者们开始将重心转向SAH后的脑损伤，特别是早期脑损伤。因此，对SAH后EBI的研究成为目前SAH方面研究的热点，并且针对其机制，寻找有效防治SAH后早期脑损伤的新靶点，成为降低其致残、致死率的关键。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种Ghrelin通过Tim
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3介导的HMGB1/NF
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κB通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法。
[0006]技术方案：为实现上述目的，本专利技术的一种Ghrelin通过Tim
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3介导的HMGB1/NF
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κB通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法，包括以下步骤：
[0007](S1)SAH模型构建；
[0008]根据研究目的，将大鼠分成三个类群；
[0009]其中第一个类群采用随机数字表将大鼠分为6组，分别为假手术组、6h、12h、24h、48h、72h，其中6、12、24、48、72为SAH术后时间；
[0010]其中第二个类群采用随机数字表将大鼠分为4组，分别为假手术组(Sham)、SAH+溶剂组(SAH)、SAH+0.02μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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L)，SAH+0.04μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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H)，在rhGhrelin
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L和rhGhrelin
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H组中SAH术后1h鼻内给予不同剂量的rhGhrelin，在Sham和SAH组中鼻内给予相同剂量的溶剂，上述溶剂为10％甘油，20mM Tris HCL；
[0011]其中第三个类群采用随机数字表将大鼠分为4组，分别为假手术组(Sham)、SAH+腺相关病毒(AAV)阴性对照组(SAH
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NC)、SAH+0.04μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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H)，SAH+0.04μg/kg rhGhrelin+AAV
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Tim
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3组(rhGhrelin
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H+T)，以上四组在SAH前3周侧脑室注射AAV
‑
Tim
‑
3和AAV
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NC；
[0012]模型构建后，用3.5％戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠固定在立体定向架上，在20s内，将300μl大鼠动脉血注入视前交叉池，假手术组注入生理盐水300μl；
[0013](S2)神经行为评分；
[0014]在SAH后48h，使用评分系统检查大鼠的行为障碍；
[0015](S3)HE染色；
[0016]麻醉后处死各组大鼠，将每组6只出血侧脑组织大鼠置于液氮中进行后续实验；各组其他大鼠脑组织以视交叉为中心，行冠状切片，常规脱蜡水合后，按照HE染色试剂盒的说明对石蜡切片进行染色，然后置于显微镜下观察颞叶基底脑组织的病理变化；
[0017](S4)ELISA；
[0018]脑组织匀浆离心后取上清液，利用ELISA试剂盒说明书测定上清液中TNF
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α、IL
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1β、IL
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6的含量，在酶标仪上检测450nm处的吸光度；
[0019](S5)TUNEL染色；
[0020]使用试剂盒进行TUNEL染色，在光学显微镜下随机选取5个视野，将棕色染色的细胞判断为凋亡细胞，计算凋亡指数以反映细胞凋亡程度；
[0021](S6)尼氏染色；
[0022]常规脱蜡和水化后，将石蜡切片加入蒸馏水中，甲酚紫罗兰染料染色30min后，用蒸馏水洗涤，然后用95％乙醇溶液进行分化，所有样品均常规脱水并密封，在光学显微镜下观察神经元，并计数存活神经元的数量；
[0023](S7)蛋白质印迹分析，测定蛋白质相对密度；
[0024](S8)RT
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PCR；
[0025]提取总RNA，然后将其逆转录为cDNA，分析mRNA的表达；
[0026]大鼠Tim
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3的引物序列，sense：GGGCTAAGATCGGTAGGTGC，antisense：CCATCTAGGCTAAGGTGCG；
[0027]大鼠β
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actin本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Ghrelin通过Tim
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3介导的HMGB1/NF
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κB通路抑制SAH早期脑损伤的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：(S1)SAH模型构建；根据研究目的，将大鼠分成三个类群；其中第一个类群采用随机数字表将大鼠分为6组，分别为假手术组、6h、12h、24h、48h、72h，其中6、12、24、48、72为SAH术后时间；其中第二个类群采用随机数字表将大鼠分为4组，分别为假手术组(Sham)、SAH+溶剂组(SAH)、SAH+0.02μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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L)，SAH+0.04μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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H)，在rhGhrelin
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L和rhGhrelin
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H组中SAH术后1h鼻内给予不同剂量的rhGhrelin，在Sham和SAH组中鼻内给予相同剂量的溶剂，上述溶剂为10％甘油，20mM Tris HCL；其中第三个类群采用随机数字表将大鼠分为4组，分别为假手术组(Sham)、SAH+腺相关病毒(AAV)阴性对照组(SAH
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NC)、SAH+0.04μg/kg rhGhrelin组(rhGhrelin
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H)，SAH+0.04μg/kg rhGhrelin+AAV
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Tim
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3组(rhGhrelin
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H+T)，以上四组在SAH前3周侧脑室注射AAV
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Tim
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3和AAV
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NC；模型构建后，用3.5％戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠固定在立体定向架上，在20s内，将300μl大鼠动脉血注入视前交叉池，假手术组注入生理盐水300μl；(S2)神经行为评分；在SAH后48h，使用评分系统检查大鼠的行为障碍；(S3)HE染色；麻醉后处死各组大鼠，将每组6只出血侧脑组织大鼠置于液氮中进行后续实验；各组其他大鼠脑组织以视交叉为中心，行冠状切片，常规脱蜡水合后，按照HE染色试剂盒的说明对石蜡切片进行染色，然后置于显微镜下观察颞叶基底脑组织的病理变化；(S4)ELISA；脑组织匀浆离心后取上清液，利用ELISA试剂盒说明书测定上清液中TNF
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α、IL
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1β、IL
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6的含量，在酶标仪上检测450nm处的吸光度；(S5)TUNEL染色；使用试剂盒进行TUNEL染色，在光学显微镜下随机选取5个视野，将棕色染色的细胞判断为凋亡细胞，计算凋亡指数以反映细胞凋亡程度；(S6)尼氏染色；常规脱蜡和水化后，将石蜡切片加入蒸馏水中，甲酚紫罗兰染料染色30min后，用蒸馏水洗涤，然后用95％乙醇溶液进行分化，所有样品均常规脱水并密封，在光...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱教学，
申请(专利权)人：烟台市烟台山医院，
类型：发明
国别省市：